CRISPR_Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展_滕小龙

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SyntheticBiologyJournal2023，4（1）：67-852023年第4卷第1期|www.synbioj.com特约评述DOI:10.12211/2096-8280.2022-047CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展滕小龙，史硕博（北京化工大学，北京软物质科学与工程高精尖创新中心，北京100029）摘要：CRISPR/Cas9是近年来发展起来的新兴技术，其在多种生物和组织的基因组上具有快速、高效、精准的基因编辑与调控能力，这使得该技术在基础科学和合成生物学等应用科学领域均得到了极大的发展与应用。本文首先对CRISPR的历史沿革、分类及CRISPR/Cas9技术的作用机制进行简述，并结合其原理和在基因组工程中面临的脱靶率高、PAM依赖性强等限制因素总结了近年来针对Cas9蛋白和向导RNA（gRNA）进行的一系列优化与改造。接下来详细叙述了CRISPR/Cas9系统结合效应蛋白实现的多种功能，包括基因表达调控、表观基因组编辑、单碱基编辑等。基于gRNA多表达策略和Cas9多路复用策略，本文还对CRISPR/Cas9技术主要的多重应用成果进行了梳理汇总。最后探讨了CRISPR/Cas9作为高精度基因组编辑工具使用的应用前景，以及作为疗法使用时的安全性和风险控制问题。关键词：CRISPR/Cas9；基因组编辑；表达调控；多重编辑；效应蛋白中图分类号：Q819文献标志码：AOptimizationanddevelopmentofCRISPR/Cas9systemsforgenomeeditingTENGXiaolong，SHIShuobo（BeijingAdvancedInnovationCenterofSoftMatterScienceandEngineering，BeijingUniversityofChemicalTechnology，Beijing100029，China）Abstract:Asanemergingtechnologydevelopedwithinrecentyears,CRISPR/Cas9exhibitsfast,efficient,andprecisegeneeditingandregulationcapabilitiesinvariousorganismsandtissues,andtheseadvantagesmakeitwidelyusedinresearchwithfundamentalsciencesandappliedtechnologiesaswellsuchassyntheticbiology.Thisreviewfirstbrieflyintroducesthediscoveryhistory,classification,andmechanismofCRISPR/Cas9.ThesystemofCRISPR/Cas9usuallycontainsasingleguideRNA(gRNA)moleculefortargetingaspecificsequence,andaCas9endonucleaseforcatalyzingadouble-strandbreak(DSB)inthesequence(targetDNAstrands).TherecognitionandcleavageoftargetDNAstrictlyrequirethepresenceofaprotospaceradjacentmotif(PAM)inthetargetsequence.TheDSB(s)canberepairedbyvariousDNArepairmechanisms,whichallowvariousgeneeditingsuchasgeneintegration,gene收稿日期：2022-09-01修回日期：2022-10-28基金项目：国家自然科学基金（21878013）引用本文：滕小龙，史硕博.CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展［J］.合成生物学，2023，4（1）：67-85Citation：TENGXiaolong，SHIShuobo.OptimizationanddevelopmentofCRISPR/Cas9systemsforgenomeediting［J］.SyntheticBiologyJournal，2023，4（1）：67-85

1068合成生物学第4卷replacement,andgeneknockout.DuetolimitationsofCRISPR/Cas9,suchasPAMdependenceandhighoff-targetrate,researchershavedevelopedvariousfusedorengineeredCas9proteinsandgRNAsthatplaysignificantrolesinfulfillingvariouspurposes.TheseCas9variantsaremodifiedforimprovingtheperformanceofPAM,inparticularitsspecificityandfidelity.Moreover,theDSBsgeneratedbyCas9areconsideredtoxictothecells,andtheuseofCas9nickase(nCas9)orcatalyticallydeficientCas9(dCas9)inCRISPRhasalsobeendevelopedwithoutgeneratingDSBs.Meanwhile,differenteffectorproteinscanbefusedwithCas9/dCas9/nCas9tobringaboutnewfunctionsandapplicationsingeneexpressionregulation,epigenomeediting,andsinglebaseediting.Moreover,weintroducethecurrentstudiesandapplicationsofmultiplegRNAexpressionstrategiesbasedonthemultiplexadvantagesoftheCRISPR/Cas9system.Ingeneral,CRISPR/Cas9systemshavegraduallybecomestandardizedandrevolutionizedgenomeeditingsystemsforalmostallpossiblegeneticmanipulations.Finally,wehighlightperspectivesonseveralapplicationsoftheversatileCRISPR/Cas9toolboxasagenomeeditingtool,anddiscussthesafetyandriskcontrolissueswhenitisusedingenetherapy.Keywords:CRISPR/Cas9;genomeediting;expressionregulation;multiplexedgenomeediting;effectorprotein对遗传信息进行编辑和对基因表达进行调控是CRISPR相关蛋白（CRISPR-associatedprotein，研究各种遗传信息的具体功能、揭示基因独特生理Casprotein）系统蓬勃发展，成为应用于基因组工机制的重要方法。进入新世纪后，来源于原核生物程中的重要技术。早在1987年，研究人员就在大［1］的簇状规则间隔短回文重复序列（clusteredregularly肠杆菌基因组上发现了这一段特殊的序列。［2］interspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）/2002年，Jansen等通过大量观察创造了CRISPR

2第4卷www.synbioj.com069缩写代替了之前发现的重复片段。随后，Brouns对过程中使用的微同源序列易导致原始断裂侧翼［3］等揭示了该系统对DNA的靶向作用及原理，从缺失，进而造成染色体异常如缺失、易位、倒位而推测出该系统具有作为基因编辑工具的潜力。和其他复杂的重排。Cas9蛋白造成DNA双链断裂［4］2013年，张锋团队首次实现CRISPR/Cas9系统后，在损伤序列的同源供体DNA如姐妹染色单体在哺乳动物细胞中的多基因编辑，开启了基因编存在的情况下，HDR则以同源DNA序列为模板进辑技术的新篇章。依据Cas蛋白的结构和进化关行无错修复。若人为地提供一段含有外源基因或系，目前CRISPR/Cas系统共分六种类型，其中替换了特定位置核苷酸的同源供体DNA（donor），Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型系统的Cas蛋白为多亚基，Ⅱ、Ⅴ、则可利用HDR实现精准的基因插入或单碱基编辑［5-6］［16］Ⅵ型系统的Cas蛋白为单亚基。由于单亚基（图1）。随着CRISPR/Cas9技术的普及和发展，CRISPR/Cas系统机制简单且易操作，目前研究成其基本的基因编辑能力和性能已不能满足在基因熟和应用广泛的大多为单亚基系统，如Ⅱ型的组工程和各个领域中的应用。例如，除了受限于CRISPR/Cas9系统、Ⅴ型的CRISPR/Cas12a（Cpf1）CRISPR/Cas9系统本身的PAM（protospacer系统和Ⅵ型的CRISPR/Cas13a（C2c2）系统等。其adjacentmotif）依赖性和脱靶效应，该系统在应用中CRISPR/Cas9系统凭借其操作简便、精准编辑、于代谢工程中时，还被其编辑靶点的数量和效率［17］多重编辑等优势，与传统的DNA修饰工具如大范所制约，而应用在人类疾病基因疗法时还需进［7］［18］围核酸酶（meganucleases，MGNs）、锌指核酸一步提高该系统的保真性、安全性等因素。因［8］酶（zincfingernucleases，ZFNs）、转录激活因子此，自张锋团队首次应用CRISPR/Cas9系统在哺样效应蛋白核酸酶（transcriptionactivator-likeeffector乳动物细胞中实现多重编辑后，国内外的科研人［9］nucleases，TALENs）等区分开来，使其在基础科员围绕该系统的多元化应用展开了研究，如通过学到应用科学领域均得到了极大的发展与应用。优化Cas9蛋白拓宽该系统的识别范围并提高其靶［19-21］CRISPR系统利用单链向导RNA（singleguide向特异性、通过融合效应结构域的方式使该系［22-24］RNA，sgRNA或gRNA）靶向目的位点，随后统获得动态可控性或进行转录调控、为了进行Cas9等核酸酶切断目的区域的双链核酸，诱导细胞表观基因组编辑或在非HDR介导的细胞中进行单内源DNA损伤修复机制工作，最终借助该机制达碱基编辑将功能缺失的Cas9蛋白与甲基转移酶或［10］［25-26］到编辑遗传信息的目的。CRISPR/Cas9系统在发脱氨酶融合等。2019年，哈佛大学DavidR.挥基因敲除、基因插入、单碱基编辑等主要编辑手Liu团队开发的先导编辑（primeediting，PE）作段时主要依靠的是细胞内源的非同源末端连接修复为基于gRNA工程的多功能精准基因编辑工具，可机制（non-homologousendjoining，NHEJ）、微同以在不引入靶基因双链断裂及同源片段的条件下源介导末端连接机制（microhomology-mediated介导靶向的插入、缺失及所有碱基编辑，大大拓endjoining，MMEJ）或同源重组修复机制展了CRISPR/Cas9系统多功能基因组编辑的范围［11］［27］（homologydirectedrepair，HDR）。NHEJ系统和能力。多重CRISPR技术是通过同时引入多个进行双链断裂（double-strandbreaks，DSBs）修复gRNA或多种直系同源Cas9蛋白，从而实现基因时，首先Ku异源二聚体识别并结合至两断裂末组上多靶点的同时靶向或多功能正交编辑。该技端，随后由DNA聚合酶和核酸外切酶对该处进行术不仅极大提高了基因编辑和转录调控的范围和加工处理，最后进行末端连接形成双链。在对末效率，更促进了强大的生物工程应用。因此，如端进行修饰时，由于外切酶和聚合酶结合顺序的今越来越多的CRISPR/Cas9工具不仅可以实现定不确定性则造成修复位点碱基缺失和插入突变等点改造，还可以实现多靶点的同时改造。发展趋［12］不同情况，致使目的基因失去活性。也有报道势证明了基于RNA靶向性的CRISPR/Cas9技术凭将Cas9蛋白靶向目的基因或染色体上两处位点，借简单可编程性和广泛适用性具有强大优势，同则会造成目的基因内或染色体上整段序列的缺时凸显出CRISPR/Cas9系统与TALENs、ZFNs等［4，13-15］［28］失。MMEJ在修复双链断裂时的断裂末端比相比的优势。

3070合成生物学第4卷图1CRISPR/Cas9系统基因编辑原理［左侧为非同源末端连接修复（NHEJ）介导的片段删除/片段插入原理图；中间为同源重组修复（HDR）介导的基因编辑原理图；右侧为微同源末端连接（MMEJ）介导的基因编辑原理图］Fig.1GeneeditingmechanismofCRISPR/Cas9systems(NHEJ-mediatedfragmentdeletion/insertion,HDR-mediatedgeneeditingandMMEJ-mediatedgeneeditingareshowndiagrammaticallyfromleftandmiddletoright)本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统近年对Cas9蛋白不断的深入研究与优化改造（表1）。来在基因组工程中的优化和发展，重点介绍Cas9酿脓链球菌（Streptococcuspyogenes）Cas9蛋白工程及gRNA高效优化和表达策略，CRISPR/（SpCas9）是第一种被应用于哺乳动物细胞基因组Cas9系统结合不同效应因子后为该系统带来的新编辑的Cas9蛋白［4，39-40］，目前仍是CRISPR系统在功能和新应用场景，并阐述了CRISPR/Cas9系统各应用领域中最常用的Cas9蛋白。在发挥靶序列在多重基因编辑策略上的研究现状和成果，最后切割的功能时，SpCas9、CRISPRRNA（crRNA）、展望与讨论了该系统作为高精度基因组编辑工具反式激活CRISPRRNA（trans-activatingcrRNA，使用时面临的问题及发展方向。tracrRNA）结合形成核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein，RNP）共同参与这一过程。在1Cas9蛋白和向导RNA的优化改造天然CRISPR/Cas9系统中，crRNA作为识别模块，其上的间隔区段能够识别与之互补的特异性靶序CRISPR/Cas9系统的高速发展离不开科研人员列（常见20个核苷酸长度），而靶序列下游必须有

4第4卷www.synbioj.com071表1　主要Cas9工程化变体、直系同源及其特性Table1MajorCas9variantsandorthologuesaswellastheirfeatures参考变体及直系同源改造位点或方式PAM特性文献SpCas9原生酿脓链球菌Cas9NGG1368个氨基酸[29]dCas9D10A，H840ANGG核酸酶活性失活[29]nCas9(D10A)D10ANGG切口酶，非靶向链切割活性失活[30]nCas9(H840A)H840ANGG切口酶，靶向链切割活性失活[30]SpCas9NGR1335V，L1111R，D1135V，G1218R，NGPAM改变；通过Cas9理性设计获得[31]E1219F，A1322R，T1337RVRERSpCas9D1135A，G1218R，R1335E，T1337RNGCGPAM改变；通过细菌选择性定向进化获得[19]VQRSpCas9D1135V，R1335Q，T1337RNGAN，PAM改变；通过细菌选择性定向进化获得[19]NGNGEQRSpCas9D1335E，R1335Q，T1337RNGAGPAM改变；通过细菌选择性定向进化获得[19]xCas9A262T，R324L，S409I，E480K，E543D，M694I，E1219VNG，GAA，PAM改变；通过噬菌体辅助持续进化获得[20]GATSpGD1135L，S1136W，G1218K，E1219Q，R1335Q，T1337RNGNPAM改变；通过SpCas9理性设计获得[32]SpRYSpG，A61R，L1111R，A1322R，N1317R，R1333PNRN，NYNPAM改变；通过对SpG进一步理性设计获得[32]evoCas9M495V,Y515N,K526E,R661QNGG保真性提高，编辑效率接近天然SpCas9[33]fCas9SpdCas9与FokI融合NGG保真性提高；通过将FokI核酸酶与dCas9融[34]合获得StCas9原生嗜热链球菌Cas9NNAGAAW1121个氨基酸[35]NmCas9原生脑膜炎奈瑟菌Cas9NNNNGATT1082个氨基酸[36]SaCas9原生金黄色葡萄球菌Cas9NNGRRT1053个氨基酸；基因组编辑效率与SpCas9相当[37]CjCas9原生曲状杆菌Cas9NNNVRYM984个氨基酸[38]注：V代表A、C或G；R代表A或G；Y代表C或T；M代表A或C。三个碱基的PAM序列NGG（N代表A、G、C和T仍大大限制其在更广范围下的应用与开发。如在中的任一碱基）；tracrRNA和crRNA上的核苷酸链人类基因组DNA上平均每8个碱基对存在一个［52］［53］有能互补配对的部分，配对后促使RNP形成以及NGG位点，Fu等在人类细胞中表征了［41-42］激活Cas9蛋白。在目前通用的CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，结果显示该系统的系统中，crRNA与tracrRNA被融合成一条sgRNA脱靶率高达66%。因此，研究人员通过工程化［39］发挥相同的作用。也有研究发现截短gRNA的Cas9蛋白或gRNA等方式，使CRISPR/Cas9系统间隔区段（如14nt的间隔区段）能够使RNP保持的靶向范围、靶向特异性和保真性均得到了拓展［43］［19-20］识别和结合靶序列的能力，但无法引入DSB；和提高。2018年，张锋团队和OsamuNureki［31］而当gRNA的间隔区段长度在16～20nt时均可有团队通过对SpCas9进行理性设计获得了能够识效进行基因编辑，且17～20nt的gRNA编辑效率别NGPAM序列的突变体蛋白SpCas9-NG，并证明［44-45］无显著性差异。最后，位于Cas9蛋白上的了其在人类细胞中的基因组编辑能力以及与胞苷HNH和RuvC结构域发挥核酸内切酶活性，分别切脱氨酶融合后仍具有单碱基编辑能力。2020年，［54］断靶向链和非靶向链，最终使靶DNA形成平末端DavidR.Liu团队利用噬菌体辅助持续进化［39，42］的双链断裂，实现“打靶”。（phage-assistedcontinuousevolution，PACE）方法尽管CRISPR/Cas9系统已在多种生物和细胞获得了三种识别非GPAM序列的SpCas9突变体，［46-51］的基因组上得到了应用，Cas9对于PAM序列从而进一步提高了CRISPR/Cas9系统的靶向范围。［32］NGG的严格识别、复杂基因组中gRNA潜在的脱Walton等通过改造与PAM序列直接作用的氨基靶效应以及该系统作为医疗手段使用时的保真性酸位点获得了能稳定识别NRNPAM序列的突变体

5072合成生物学第4卷蛋白SpRY，同时其能以较低效率识别NYNPAMCRISPR/Cas9系统的不足与应用范围外，对Cas9序列，使其在靶点识别上几乎不受PAM限制。Hu直系同源蛋白进行挖掘和开发也能够使该系统识［20］等应用PACE方法获得一种能够识别NG、别范围得到极大扩展。如来自嗜热链球菌GAA及GAT等PAM序列的SpCas9突变体xCas9，（Streptococcusthermophilus）的StCas9能识别同时其能以优于SpCas9的特异性靶向NGG，且对［4，35］NNGAAW（其中W代表A或T）的PAM序列，各种PAM的靶向能力均在人类细胞中的基因编辑、来自脑膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis）的转录调控以及胞嘧啶与腺嘌呤核苷酸的碱基修饰［36，60-61］NmCas9识别NNNNGATT序列，来自金黄［34］中得到了应用。2014年，Guilinger等将FokⅠ核色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的SaCas9识酸酶与核酸酶活性失活的Cas9蛋白（catalytically［37］别NNGRRT序列（其中R代表A或G），这些inactiveCas9，dCas9）融合后得到了一种融合蛋白SpCas9同源蛋白或其组合应用均已在细菌和哺乳fCas9，只有两个fCas9单体同时结合在靶基因附近动物细胞中得到了开发。此外，SaCas9在肽链长时才能切割目的基因，使其在人类细胞中进行基度较小的条件下（1053个氨基酸，SpCas9含有因编辑的特异性比野生型Cas9提高了140倍。多1368个氨基酸）拥有与SpCas9相当的编辑效率，种研究已报道了将SpCas9或sgRNA工程化后，通这使其在大小受限制的传递载体如腺相关病毒过质粒载体携带并表达CRISPR/Cas9系统或通过（adeno-associatedvirus，AAV）中得到广泛应用。RNP递送的方式均能够在基因组范围上降低来自曲状杆菌（Campylobacterjejuni）的CjCas9多CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，并显著提高该系统肽链上仅含984个氨基酸，能识别PAM序列［33，55-58］［33］的保真性。2018年，Casini等筛选并表NNNVRYM，已被报道可以通过AAV递送至小鼠征了能够提高CRISPR/Cas9系统编辑效率的Cas9肌纤维和视网膜色素上皮细胞（retinalpigmentREC3结构域突变库并组合了四种有利突变后，获［38］epithelium，RPE）中并成功进行基因编辑。工得了一种保真性比野生型SpCas9提高了79倍的突程化的新型Cas9突变体、gRNA与Cas9直系同源变体蛋白evoCas9，同时编辑效率接近野生型的不断发掘为CRISPR/Cas9系统在各种背景下的SpCas9。除了对Cas9蛋白进行优化，对gRNA不应用提供了源源不断的新方法和工具，也证明了断进行工程化改造也能使CRISPR/Cas9系统的性该系统作为第三代“基因剪刀”目前仍然处于高［44］能得到显著提升。2014年，Fu等证明了间隔区速发展阶段。该系统中存在的PAM依赖性、脱靶截短后的gRNA的脱靶率明显低于全长的gRNA率较高等问题都需要利用进化工程或计算机辅助（20nt），最大降低幅度达5000倍。2019年，理性设计等方式对Cas9蛋白进行进一步探索和改［21］Kocak等在工程化设计的sgRNA上的间隔区加造才能得到解决，使其能够在更多的场景下最大入一“发夹”形RNA二级结构，该结构能够在发程度地发挥自身高灵活性、高精准性、易编程性生脱靶编辑时在脱靶位点处提高gRNA或crRNA链的优势。入侵的热力学屏障而并不影响中靶效率，使CRISPR系统的特异性增加了两个数量级。2020年，［59］基于过短的gRNA（间隔区小于16nt）2效应蛋白为CRISPR/Cas9系统带来Rose等与Cas9形成的RNP只能结合却不能切割靶位点特的功能优化和发展性设计的失活RNA（dead-RNAs，dRNAs）可保护多个脱靶位点，从而使得SpCas9的靶向特异性CRISPR/Cas9系统丰富多样的应用除了对提高了40倍。相较于工程化改造的高特异性Cas9Cas9蛋白的不断优化与改造外，Cas9作为一种单突变体来说，通过缩短gRNA的间隔区来提高靶向亚基核酸酶还可与各种效应蛋白融合并起作用的特异性的方法在设计和应用方面均更易用和灵活，特性更让该系统在基因表达调控、单碱基编辑、预计将成为未来的研究热点方向。表观遗传修饰等应用领域得到了极大扩除了开发Cas9的突变体以弥补和拓展展（表2）。

6第4卷www.synbioj.com073表2CRISPR/Cas9系统融合效应蛋白带来功能优化Table2FunctionaloptimizationthroughfusionexpressionofeffectorproteinswithCRISPR/Cas9system功能效应蛋白或gRNA工程系统特征参考文献表达调控无dCas9原核生物基因抑制表达，真核生物基因抑制效率低[22]KRAB，MXI1，TUP1抑制结构域dCas9可在真核生物中抑制基因表达[62-63]KRAB-MeCP1融合抑制结构域dCas9在哺乳动物细胞中高效抑制目的基因表达[64]p65，VP64激活结构域dCas9激活基因表达，效率较低[65-66]VP64-p65-Rta（VPR）融合激活结构域dCas9与VP64相比提高了22～320倍；多重基因激活表达；[67]刺激iPSCs神经元分化gRNA工程；gRNA上携带携带两个MS2发夹二dCas9每个发夹结构招募一个MS2-p65-HSF1融合激活蛋[68]级结构白；与VP64相比，使10个靶基因上调2倍以上SPY系统（包括SpyTag和SpyCatcher）和Med2激dCas9招募多拷贝SpyCatcher和Med2融合蛋白使酿酒酵母[69]活结构域目的基因表达提高34.9倍SunTag系统（包括GCN4肽和抗GCN4抗体的单dCpf1招募多拷贝ScFv与MIG1融合蛋白使酿酒酵母目的[69]链可变片段scFv）和MIG1抑制结构域基因受到95%的抑制表观基因KRAB-DNA甲基化酶催化结构域融合蛋白dCas9融合抑制因子和甲基化酶；造成目的基因78%的稳定[70]组编辑沉默两侧分别融合KRAB和Dnmt3A-Dnmt3L融合dCas9在干细胞分裂分化为神经细胞后仍维持DNA甲基化[71]DNA甲基化酶结构域和基因抑制TET1甲基胞嘧啶双加氧酶1催化结构域dCas9dCas9-TET1靶向至BRCA1基因启动子后成功地上[72]调其表达水平人类组蛋白乙酰基转移酶p300催化核心dCas9催化组蛋白H3第27位赖氨酸残基的乙酰基化；基因[73]表达上调单碱基编辑胞嘧啶脱氨酶，腺嘌呤脱氨酶nCas9在不造成DNA双链断裂的条件下使目的碱基产生C:[30,G与T:A或A:T与G:C的碱基对替换74-75]CBE-UGI融合蛋白nCas9UGI能够防止胞嘧啶C脱氨后的尿嘧啶U被切除，从[30]而显著提高了CBEs的编辑效率单链DNA结合结构域ssDBD融合到胞嘧啶脱氨nCas9通过延长ssDNA的暴露时间极大地提高CBEs的编[76]酶与nCas9之间辑效率；使CBEs的编辑窗口范围得到了提高组合nCas9、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶-DNA糖基nCas9首次实现大肠杆菌中C到A87.2%和哺乳动物细胞C[77]化酶到G5.3%至53.0%的编辑效率先导编辑通过gRNA工程改造的pegRNA；与逆转录酶融合nCas9改变pegRNA可实现精确的碱基替换、基因敲除和插入[27]通过gRNA工程改造的pegRNA；与逆转录酶和nCas9融合单链DNA结合蛋白Rad51使PE2的编辑效率最[78]Rad51融合高提升2.6倍在CRISPR/Cas9的基因转录调控系统中，对效应蛋白如转录激活因子或抑制因子、表观遗传Cas9蛋白工程化的dCas9分别在RuvC和HNH结构修饰因子、碱基编辑器甚至具有特定功能的酶等域发生突变使得RNP复合物仅能发挥靶序列识别融合后，研究人员便能够借助CRISPR/Cas9系统［29］功能，而无法切断核苷酸双链。nCas9（Cas9对靶序列实现特定生物学功能，如表征转录基因nickase）是仅能使靶DNA发生单链断裂（single-乃至基因组上非编码区的功能、通过将碱基编辑strandbreak，SSB）的Cas9突变体，其中nCas9器与nCas9融合能够在HDR活性低的细胞中进行（H840A）和nCas9（D10A）分别是Cas9在HNH精确高效的单碱基编辑等。因此本节将重点回顾和RuvC结构域发生突变后的突变体蛋白，从而能与总结多种多样的效应蛋白为CRISPR/Cas9系统够使该结构域失去内切酶活性，使DNA单链断带来的多元化优化和发展，以及赋予该系统的多［22，39］裂，产生“缺口”。将dCas9或nCas9与各种种新功能。

7074合成生物学第4卷［9］2.1CRISPR/dCas9-Effector系统的转录调控围的转录调控蛋白文库相当耗时且价格昂贵。功能CRISPR基因调控系统包括CRISPR激活系统（CRISPRactivationsystem，CRISPRa）和CRISPR转录因子通过结合或识别基因上游特定区域，干扰系统（CRISPRinterferencesystem，CRISPRi），进而调节RNA聚合酶的招募，最终使靶基因表达该系统将转录激活或抑制因子与dCas9蛋白融合［79-80］上调或下调。其不仅可以与启动子区域结合，后，借助CRISPR系统精准的靶向性和灵活的可编多个转录因子间也可结合形成转录因子复合体进程性将融合蛋白靶向至目的基因从而对该基因的而对靶基因进行更复杂、精细的调控，促进或抑［62，81-88］转录进行激活或干扰（图2）。不同于其他制DNA上遗传信息向RNA转录的过程。在基因组范围上对靶基因进行调控是探究基因功能、重塑DNA靶向蛋白，CRISPR激活系统的dCas9-effector代谢调控网络的重要方法［62］。自20世纪末以来，融合蛋白利用gRNA与靶序列的碱基互补配对进行研究人员就已经将自然存在的或工程化后的DNA精确定位并最终实现目的基因调控，同时gRNA的［81-82］［83］易编程性和dCas9蛋白较小的体量使该系统在基因靶向蛋白如四环素阻遏蛋白、Gal4蛋白、［84］［85-87］锌指蛋白以及TALE蛋白等与转录因子融组范围上进行调控成为了可能。合进行靶基因调控。但由于依赖蛋白质靶向DNA仅将dCas9蛋白靶向至目的基因上游时，的特性，靶向不同的DNA序列时需要工程化设计dCas9蛋白对RNA聚合酶的空间位阻效应便可在不同的蛋白质氨基酸序列，使得这些蛋白普遍可［22］一定程度上抑制基因表达，而该效应抑制表达编程性较差且分子庞大，因此开发用于基因组范的方式仅在原核细胞中有较高的效率，在真核细图2CRISPR/Cas9系统的功能优化与拓展Fig.2FunctionaloptimizationandexpansionofCRISPR/Cas9systems

8第4卷www.synbioj.com075胞中由于其内部复杂的调控机制使得抑制效率较活表达与刺激人诱导多功能干细胞（induced［22，62，89］低。将dCas9蛋白与转录抑制结构域如pluripotentstemcells，iPSCs）的神经元分化上发挥［62］［62］［63］KRAB、MXI1和TUP1等蛋白融合表达作用。同年，张锋研究团队［68］开发的基于CRISPRa则可提高CRISPRi系统在真核细胞中的抑制效率。的协同激活介导系统（synergisticactivation其中KRAB锌指蛋白（KRAB-ZFP）属于哺乳动物mediatorsystem，SAM）通过修饰sgRNA使其携带［90］细胞中最大的转录调节因子家族，该蛋白能够了两个MS2发夹二级结构，每个发夹结构都能招通过诱导靶序列的染色质结构变化从而抑制基因募一个MS2-p65-HSF1融合蛋白，其中包括反式激［91］转录。KRAB与dCas9融合后被靶向至启动子活因子p65、MS2结合蛋白以及热休克蛋白1区、5′非翻译区以及近端或远端增强子元件区后［62，92-94］（heatshockprotein1），最终证明该修饰后的gRNA可以有效地沉默单个基因或非编码RNA。［64］与dCas9-VP64的协同作用能够使10个靶基因的表2018年，Yeo等表征了20多种已知的能够诱导基因沉默的转录因子的抑制效率后，将获得的最达均上调2倍以上。2022年，山东大学候进课题［69］高效的6种抑制因子——MeCP2、SIN3A、HDT1、组构建的CRISPR介导的蛋白质标签信号放大MBD2B、NIPP1和HP1A分别与通用抑制因子系统首次将SPY系统（包括SpyTag和SpyCatcher）KRAB融合形成双重抑制因子，再与dCas9蛋白C和SunTag系统分别引入dCas9介导的CRISPRa和端融合表达并表征CRISPRi系统的抑制效率，最dCpf1（一种丧失核酸酶活性的Cas9同源蛋白）介终获得了比单独dCas9抑制效率提高了60倍的双导的CRISPRi系统并进行骨架长度和转录因子优重抑制因子融合蛋白dCas9-KRAB-MeCP2。而之化后，成功使酿酒酵母内目的基因转录水平分别后研究人员继续表征的三重抑制因子融合蛋白可提高了34.9倍以及受到几乎完全的抑制。其中，能由于功能冗余或蛋白体量较大从而影响抑制因SunTag系统是由若干个拷贝的GCN4肽以及作为子正常工作导致抑制效率不如双重抑制因子，证［95］标签的抗GCN4抗体的单链可变片段scFv组成，明了通过无限累加融合的方式提高融合蛋白的调［64］与dCas9融合的多拷贝GCN4肽通过招募多拷贝的控效率是不可行的。转录因子与GCN4抗体标签的融合蛋白从而进行转将dCas9与各种转录激活因子融合后，则可在gRNA的靶向作用下精确激活目的基因，该系统称录调控，该系统除了与CRISPR系统结合后用于碱为CRISPR激活系统或CRISPRa。最初的CRISPRa基编辑以及基因调控，还在哺乳动物和植物细胞系统中dCas9仅融合了单个反式激活因子p65（也的DNA的甲基化和去甲基化诱导中发挥作被称为RelA，是构成NF-κB转录因子家族的五种［96-100］用；而SPY系统作为一种广泛使用的蛋白质成员之一）或VP64（由单纯疱疹病毒蛋白VP16组装系统首次在酿酒酵母的转录调控中得到了应的四个重复结构域构成），这些早期工作共同构成［69］用。可见在dCas9与转录因子融合的基础上，了最初的可编程dCas9基因激活工具箱，但效果差CRISPRa与CRISPRi系统能够利用融合多重结构［23-28，39-44，62，65-66］强人意。为了不断提高CRISPRa系域或融合蛋白质骨架系统的方式提高调控效率。统的激活效率，研究人员尝试了用各种方式将更而通过利用RNA与蛋白质间的相互作用，将多个复杂或多拷贝的激活结构域应用于CRISPRa。适配子融合在gRNA中使其同时含有目的基因靶向［67］2015年，Chavez等通过蛋白质理性设计，构建序列和转录因子招募序列的方式能够产生与dCas9了三重融合激活因子VP64-p65-Rta（VPR）并应用融合多个转录激活或抑制结构域的策略类似的效于CRISPRa系统，其中Rta是来源于EB病毒［101］果。此外，针对不同细胞乃至不同dCas9同源（epstein-barrvirus）的反式激活因子。与dCas9-VP64相比，dCas9-VPR使人胚胎肾细胞293蛋白，CRISPRa与CRISPRi系统均需对不同转录（HEK293Tcells）的内源靶基因表达上调了22～激活或抑制结构域乃至其组合进行优化才能发挥320倍，同时证明了该系统也能够在多重基因的激该系统的最大效能。

9076合成生物学第4卷2.2CRISPR/dCas9-Effector系统的表观基因2.3CRISPR/nCas9-Effector系统的单碱基编组编辑功能辑功能通过使用基于CRISPR/dCas9系统的一系列融单点突变是人类遗传病中最常见的基因变异，合蛋白工具可以实现诸多靶向的表观遗传修饰，且该变异通常会造成严重的后果。如镰刀形红细如DNA甲基化和去甲基化、组蛋白乙酰基化/去乙胞贫血症患者由于其血红蛋白基因中一对碱基对酰化和甲基化/去甲基化等，从而调控基因的表达发生突变使得血红蛋白β亚基的N端第6个氨基酸并在许多细胞过程、癌症治疗及细胞工厂中发挥发生改变，最终使血红蛋白结构发生改变并失去［30］［104］关键作用（图2）。其中DNA甲基化如5′胞嘧啶氧气输送功能。因此，利用CRISPR/Ca9系统甲基化（5mC）是一种稳定的抑制性化学修饰调的靶向性进行高效的单核苷酸转换是建立遗传病控。2016年，研究人员将dCas9、KRAB转录抑制模型、开发基因纠正疗法的重要手段，同时促进因子以及DNA甲基化酶（DNAmethyltransferase）了基础生物学研究和合成生物学的发展。通过共的催化结构域融合蛋白基因与7个gRNA在K562递送一段含有待编辑碱基的同源DNA，CRIPSR/细胞中共表达后获得了β-微球蛋白启动子-增强子Cas9系统可在HDR活性高的细胞中以较高的效率2［70］［71］［16］78%的稳定沉默。2021年，Nunez等开发的将目的碱基替换为任意碱基，而在HDR活性较CRISPRoff甲基化修饰工具能够在细胞分裂及分化低的细胞如大多数细菌和有丝分裂后期细胞中，过程中稳定维持靶基因的甲基化并抑制其表达水该策略则无法正常发挥作用。此外，诱导HDR时平。DNA去甲基化是将甲基胞嘧啶双加氧酶1Cas9对靶序列产生的双链切割带来的脱靶诱变风（methylcytosinedioxygenase1，TET1）的肽链C端险以及HDR进行DNA修复时对细胞活力产生的不催化结构域与dCas9融合后，再靶向至目的基因启利影响均会使CRIPSR/Cas9系统在遗传病的基因［105-106］动子或增强子区，从而实现目的基因的表达上调。疗法等应用场景上受到限制。［72］2016年，Choudhury等将dCas9-TET1靶向至乳为了改善CRIPSR/Cas9系统的碱基编辑工具腺癌基因1（breastcancer1，BRCA1）启动子后成箱，研究人员通过将nCas9与胞嘧啶脱氨酶功地上调其表达水平。BRCA1作为抑制恶性肿瘤（cytosinedeaminase）或腺嘌呤脱氨酶（adenine发生的关键基因之一，其成功的靶向上调为研究deaminase）融合的方式在不造成DNA双链断裂的癌变新疗法带来新的思路，证明了通过去甲基化条件下使目的碱基产生C：G与T：A或A：T与G：C靶向激活人类肿瘤抑制基因的疗法是可行的。同的碱基对替换（图2），其中相应的融合蛋白分别样的，将dCas9与人类组蛋白乙酰基转移酶p300被称为胞嘧啶碱基编辑器（cytosinebaseeditors，［30，74］的催化核心融合后靶向至启动子和增强子区从而CBEs）和腺嘌呤碱基编辑器（adeninebase［75］催化组蛋白H3第27位赖氨酸残基的乙酰基化也会editors，ABEs）。CBEs中的胞嘧啶脱氨酶能使［73］［102］造成较强的基因上调。2019年，Chen等通被nCas9释放的单链DNA（singlestrandDNA，过提高麦角生物碱合成基因簇（ergotalkaloidssDNA）上的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，随后该位synthesisgenecluster）的组蛋白乙酰化水平，使麦置产生的U：G错配碱基对被修复为T：A碱基对；角菌Cp-1菌株（ClavicepspurureaCp-1strain）中相应的，ABEs中的腺嘌呤脱氨酶使腺嘌呤A水解的麦角生物碱含量提高了一倍。通过融合dCas9与脱氨为次黄嘌呤I，随后DNA聚合酶能将次黄嘌呤适当的表观遗传效应蛋白，CRISPR表观遗传工程I识别为鸟嘌呤G进行复制，互补链上原来与腺嘌工具则可利用CRISPR系统稳健地靶向性实现各种呤A配对的胸腺嘧啶T则会相应变成胞嘧啶C，至［107］所需的表观遗传修饰，而不同工具间的适当组合，此完成碱基置换全过程。由于不存在天然的［75］［108］理论上讲可以为表观遗传学工具箱带来更多新型ssDNA腺嘌呤脱氨酶，Kim等通过定向进和功能复杂的应用策略，如利用与CRISPRa和化改造得到一种大肠杆菌（Escherichiacoli）tRNACRISPRi优化策略类似的方式优化CRISPR表观遗来源的腺嘌呤脱氨酶ecTadA（E.coliTadA）突变［103］传工程工具箱的特异性、稳定性和性能。体TadA*。由于在天然环境（大肠杆菌）中TadA

10第4卷www.synbioj.com077是以同型二聚体的方式发挥作用，所以最初的碱基编辑器的性能不断提升，A：T到G：C和C：GTadA*-nCas9融合蛋白在哺乳动物细胞中的编辑效到T：A碱基对的单向固定替换仍限制着BEs作为率并不高，直到研究人员将野生型TadA单体、进单碱基改变工具使用时的灵活性。2020年，Zhao化的突变体TadA*及nCas9整合到一起（TadA-［77］等通过组合nCas9、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶TadA*-nCas9），才使ABE在哺乳动物中的编辑效-DNA糖基化酶（uracil-DNAglycosylase，Ung）［109］率大大提高。2018年，DavidR.Liu团队工程实现了大肠杆菌中C到A87.2%的编辑效率和哺乳化改造并优化了ABE7.10后获得的ABEmax最高动物细胞C到G5.3%～53.0%的编辑效率。先导编可获得前者7.9倍的编辑效率，是目前为止在哺乳辑作为一种多功能编辑手段，虽然同时具备可编动物中编辑效率最高的ABEs。为了方便体内编程性和高精确度，但对于单碱基编辑的效率仍与辑，该团队［110］在2022年7月发表的紧凑型ABEs［28］［78］BEs有较大差距。2021年，Song等构建的递送系统通过将小型腺嘌呤编辑器SaABE8e及其hyPE2在PE2的基础上融合加入了一个ssDBD结构PAM变体SaKKH-ABE8e的基因长度最小化以及域Rad51，使得PE2的编辑效率最高提升了2.6倍，AAV组件基因长度最小化后使得ABEs能够进行单同时该团队还通过深度学习开发了能够预测不同AAV递送，且在肝脏（66%）、心脏（33%）和肌的hyPE2与PE2相比编辑效率提升倍数的计算模型肉细胞（22%）中的编辑效率均高于双AAV递送PEselector，该工具的网址为http：//deepcrispr.info/系统。同年，吉林大学李占军团队和赖学良团PEselector。2022年，Velimirovic等［112］通过高通［111］队合作开发的紧凑型的Cas9（Cje2Cas9和量肽链自编辑测序（peptideself-editingsequencingCje3Cas9）能够与sgRNA一起包装到单个AAVassay，PepSEq）测出12000个85个氨基酸的肽段中，并在成年小鼠肝脏中以12%的效率成功编辑对PE效率的影响，从而通过肽链融合提高PE的效Pcsk9基因，最终有效降低了小鼠体内的胆固醇水率。综上所述，基于CRIPSR/Cas9系统的碱基编平。高效的单AAV递送系统的开发不仅确立了其辑器编辑效率、编辑精度的不断提高以及编辑窗相对于双AAV递送系统的优势，还促进了口乃至碱基固定替换模式的扩展相对于大量已知CRISPR/Cas9系统作为体内碱基编辑工具时的研且不断增加的遗传病相关点突变数量仍捉襟见肘，究和治疗应用，具有巨大的临床治疗价值。为各种脱氨酶赋予CRIPSR/Cas9系统的碱基编辑能［76］了改善编辑效率，Zhang等通过将单链DNA结力在其他结构域如UGI和ssDBD加持下不仅能够合结构域（single-strandedDNA-bindingdomain，发挥CRIPSR系统高效率、高灵活、易编程的优ssDBD）融合到胞嘧啶脱氨酶与nCas9之间从而延势，也能够充分发挥脱氨酶的效能，但仍需进一长ssDNA的暴露时间，可在不增加插入缺失突变步优化它们以有效地转换碱基和在无旁观者编辑（indels）、细胞毒性或脱靶效应等负面效应概率的效应的条件下进行目的碱基替换。条件下极大地提高CBEs的编辑效率。ssDBD的融合还使CBEs的编辑窗口范围得到了提高，从而拓宽了其靶向作用范围及用于疾病建模和基因治疗3CRISPR/Cas9系统多重性的发展及［30］的适用范围。DavidR.Liu团队在CBE的基础应用上融合了尿嘧啶糖基化酶抑制剂（uracilglycosylaseinhibitor，UGI），作为一种体量较小的3.1多重CRISPR/Cas9的实现策略蛋白（9.5kDa），UGI能够防止胞嘧啶C脱氨后的尿嘧啶U被切除，从而显著提高了CBEs的编辑效多重编辑是CRISPR/Cas9系统与TALENs、率。该团队还发现通过招募多拷贝的脱氨酶或更ZFNs等核酸酶相比最大的优势所在，其意味着多改其空间位置以优化编辑窗口能有效提高编辑效个gRNA或Cas9能够同时表达从而极大地提高了率和特异性。此外，与nCas9融合的脱氨酶若工程CRISPR/Cas9系统进行基因编辑或转录调控的效率化改造后具有序列偏好性，则可通过降低旁观者和靶向范围，多重编辑性使该系统在生物工程领编辑效应从而提高编辑精度。尽管ABEs和CBEs域得到极大应用和发展。gRNA作为CRISPR系统

11078合成生物学第4卷的“向导”，其效率和数量关乎系统的实际效能和Csy4处理单转录本中的多个gRNA，并最终获得高运转速度，因此能够提高单细胞内gRNA种类和数达96%四基因同时敲除效率，并借助CRISPRi系量的多gRNA表达策略一直是CRISPR系统的研究统对3个靶基因进行了稳定的扰动，证明了使用焦点。Csy4可以快速有效地进行多重基因组编辑和基因目前，多gRNA的表达策略主要有三种（图3）：［114］调控。基于此，McCarty等开发的酵母模块化①每个不同gRNA表达盒通过PolⅢ启动子单独启克隆多gRNA快速组装策略通过两步PCR反应及［4］动表达，表达盒之间串联在一起；②多个不同一步GoldenGate反应可在两天内实现单阵列12个gRNA在一个表达盒内由PolⅡ或PolⅢ启动表达gRNA的组装，每个gRNA两侧都有Csy4识别位点为一条转录本，然后再通过mRNA上gRNA之间从而将转录本加工为成熟的gRNA。同年，刘子鹤的tRNA序列切割加工机制、核酶自切割能力或［115］团队基于tRNA转录本切割机制构建了一种［11］Csy4核酸酶切割释放为成熟的gRNA；③一条gRNA-tRNA阵列多gRNA表达系统（GTR-转录本内的多个gRNA也可以在CRISPR系统自然CRISPR系统）并成功在酿酒酵母中以80%的效率的自我加工活性的基础上被切割释放为成熟同时敲除8个基因。通过使用更快速的Lightning［4］gRNA。2013年，Cong等依据CRISPR基因位GTR-CRISPR系统，该团队成功在10天中敲除了点的间隔区排列的自然结构，首次将PolⅢ驱动的8个目的基因，简化了酿酒酵母的脂质代谢网络，表达盒串联实现两个靶基因间隔区的多表达并成最终获得了游离脂肪酸30倍的提升效果。该系统［113］功编辑。2018年，Ferreira等首次在酿酒酵母的开发在极大地提高了CRISPR/Cas9系统用于酿（Saccharomycescerevisiae）中利用铜绿假单胞菌酒酵母基因组多重编辑效率的同时也揭示该系统（Pseudomonasaeruginosa）来源的核酸内切酶在多重应用领域蕴藏的巨大潜力。图3　多gRNA表达策略Fig.3StrategiesforsimultaneousexpressionofmultiplegRNAs

12第4卷www.synbioj.com079［120］3.2多重CRISPR/Cas9的应用的紫罗兰素生物合成途径产物。Lobs等在对一株马克思克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）基于gRNA的多表达、多个同源Cas9或dCas9中乙酸酯的主要代谢途径和前体物质进行鉴定后，蛋白同时表达则可实现CRISPR系统的多路复用正利用CRISPRi系统对ACO2b、SDH2、RIP1和［36，116］交编辑或多功能组合代谢工程。自2013年MSS51四个基因进行多重调控，最终获得了乙酸［117］Jiang等证明了肺炎链球菌原生CRISPR/Cas9系乙酯3.8倍的提升。2017年，Lian等［119］在表征了统具备多重应用潜力后，研究人员基于gRNA多表多种同源Cas9蛋白的基因敲除、转录激活和转录达策略在大肠杆菌、酿酒酵母等模式生物体中开抑制效率后，优化并组合三种同源蛋白最终构建展了多项CRISPR系统的多路复用应用研究，从而了一套完全正交的三功能CRISPR代谢调控系统。在合成生物学及生物制造领域实现对底盘细胞的由于正交的Cas9同源蛋白所识别的PAM序列不改造，最终提升目标产品产量或改变细胞特同，发挥不同功能的同源Cas9之间互不干扰，使性（表3）。得两个被调控报告基因的表达强度均被激活和抑［118］2015年，Zalatan等通过多sgRNA表达盒制了5倍，并使第三个报告基因的敲除效率达到了策略及sgRNA工程将适配体与识别区结合，将配95%。该系统通过一步组合调控使得改造的酿酒酵体与转录因子融合表达后同时对3个目标基因进行母中胡萝卜素产量提升了3倍，同时使表面葡聚糖激活或抑制调控，最终在酿酒酵母中获得了不同酶展示量提高了2.5倍。原核生物具有相对较低的表3　多重CRISPR/Cas9系统应用研究Table3ResearchontheapplicationsofthemultiplexedCRISPR/Cas9system靶向目标参考宿主细胞多重CRISPR策略应用/概念验证数量文献哺乳动物细胞2个间隔区通过天然CRISPR序列自我2个靶标对1个靶基因敲除，效率为1.6%[4]加工(1个基因)酿酒酵母Casy4核酸酶加工3个基因同时对3个不同启动子进行激活，使得3个报告基因荧光[113]强度提升了2倍酿酒酵母基于Csy4核酸酶加工的多gRNA快速12个靶标通过12个gRNA靶向使得3个报告基因荧光强度分别被抑[114]组装(3个基因)制了92%、81%和95%酿酒酵母基于tRNA转录本切割机制的多gRNA8个基因通过两轮8个基因的敲除获得了30倍的游离脂肪酸产量[115]表达系统酿酒酵母多个gRNA表达盒通过polⅢ启动子3个基因将适配子与gRNA融合进行多基因调控，获得了不同的紫[118]启动罗兰素生物合成产物酿酒酵母基于Csy4核酸酶加工的多gRNA快速3个基因通过组合调控使两个报告基因表达分别被抑制和激活5[119]组装策略及多Cas9正交组合调控倍，同时以95%的效率敲除第三个基因酿酒酵母通过质粒表达多个gRNA表达盒以及3个基因通过对三个基因分别进行编辑、激活和抑制获得了α-檀香[43]截短gRNA用于调控烯2.66倍的产量马克思克鲁维酵母基于tRNA转录本切割机制的多gRNA6个靶标通过对4个基因进行调控，使乙酸乙酯的产量提升了3.8倍[120](Kluyveromyces表达系统(4个基因)marxianus)大肠杆菌多个gRNA表达盒通过质粒表达3个基因通过对3个基因进行组合调控得到了2.3倍苹果酸产量菌株[121]大肠杆菌多个gRNA表达盒通过质粒表达3个基因对苹果酸合成途径基因进行组合调控后获得了2.3倍苹果[121]酸产量菌株枯草芽孢杆菌多个gRNA表达盒整合至基因组3个基因通过多基因动态组合调控提高了N-乙酰葡糖胺产量[122](Bacillussubtilis)天蓝色链霉菌多个gRNA表达盒与dCas9在质粒上4个基因通过对4个靶基因同时进行抑制，使其mRNA表达量降为[123](Streptomyces表达对照的2%～32%coelicolor)

13080合成生物学第4卷代谢网络复杂性，同时其无核膜包被的拟核能够建具备了前所未有的效率。多种Cas9直系同源及实现转录与翻译同时进行，这使得原核生物（如其工程化蛋白结合各种效应蛋白的应用使CRISPR/大肠杆菌）成为多基因操作及表达调控的模式生Cas9系统工具箱不仅仅局限于靶DNA双链断裂［122-123］［121］物。2018年，Gao等通过多重CRISPRi上，而是以一种全方位、高精确度、多靶点的方系统对苹果酸生物合成途径中的基因进行组合调式操控基因组或整个代谢通路。随着该系统在基控后得到了2.3倍的苹果酸产量菌株。础生物学研究、基因疗法学、合成生物学等领域此外，通过修饰gRNA如使其融合适配子或改的高速发展，为了不断满足特定需求，CRISPR工变gRNA识别区长度，就可能实现CRISPR系统的具库及其涵盖元素将得到不断发展与拓展。［124］多重编辑或调控。2020年，Fan等通过研究证尽管研究人员针对CRISPR系统的PAM序列实了不同长度的gRNA-DNA互补区会对HNH和依赖性、编辑脱靶率等问题给出了一些解决方案RuvC结构域切割靶向链和非靶向链的能力产生影如发掘Cas9同源蛋白、通过工程化改造Cas9或响，并基于此开发了一种使两个靶基因分别产生gRNA从而拓宽PAM序列识别范围和提高中靶率DSB和C-T碱基转换的双功能编辑系统。同年，浙等，这些问题依然困扰着CRISPR系统在更多生物［43］江大学徐志南组通过gRNA工程构建了一种能中进行快速、高效、精准的基因编辑和调控，尤同时进行基因激活、抑制和编辑的三功能CRISPR其是在最终将CRISPR系统作为基因疗法使用时，系统（CRISPR-ARE）。该系统在仅使用Cas9-VPR其风险控制、脱靶编辑等问题一直都被科研人员一种CRISPR融合蛋白的条件下，利用截短的重视。为了减少脱靶效应、提高基因编辑的精确14bpgRNA实现靶基因的激活和抑制，并利用正［125］性和可控性，Liu等将一种Cas9突变体iCas9常的20bpgRNA实现目标基因敲除。尽管目前的与雌激素受体的激素结合结构域（hormone-gRNA多表达策略已逐渐成熟，对于gRNA在细胞bindingdomainoftheestrogenreceptor，ERT2）融内的多路复用机制及其对Cas9竞争作用的了解仍合后，可使iCas9的核酸酶活性获得4-羟基三苯甲有待加强。多gRNA策略（包括Csy4、核酶和胺（4-hydroxytamoxifen，4-HT）诱导性，从而快tRNA等）的处理效率将在确定理论上的gRNA数速和可逆地控制该系统在基因组编辑功能上的作量上限方面发挥关键作用，在未来的研究中，创［126］用。2017年，Shin等发现了抗CRISPR蛋白建和处理长阵列的策略将会得到优化和加强。AcrIIA4对CRISPR/Cas9系统的抑制作用，使人为控制CRISPR系统作为疗法使用时的风险成为可［127］4总结和展望能。2021年，Jain等将AcrIIA4与二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHRF）融合后使CRISPR/Cas9系统凭借其在基因组编辑和调控其仅在甲氧苄啶（trimethoprim，TMP）存在时才上的成本低廉、稳定高效、易编程性、多重编辑能抑制Cas9和DNA的结合能力，从而实现对Cas9等众多优势，已成为21世纪生命科学革命的主要编辑和dCas9基因组扰动的化学调控，提高了推动力。本文通过总结近年来CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统的特异性和生物安全性。2022年，［128］的主要研究成果，展现出该系统作为第三代“基北京大学胡家志课题组揭示了CRISPR/Cas9系因剪刀”的多元化发展趋势和活跃生命力。其中统在基因编辑过程中造成染色体易位的分子机制，包括：通过对Cas9蛋白、gRNA工程优化和挖掘随后将优化过的人源TREX2蛋白与Cas9相偶联生直系同源拓展PAM识别能力、降低脱靶率和提高成Cas9TX，其能抑制基因编辑过程中的染色体易特异性等；通过融合多种效应因子使该系统获得位、大片段缺失等染色体结构异常的产生，使前所未有的能力，如高效调控基因表达、进行表CRISPR/Cas9的基因编辑安全性大大提高。这些研观遗传修饰、通过先导编辑或BEs进行不引起双链究最终将服务于基于CRISPR/Cas9工具箱的单基断裂的碱基编辑等；基于多gRNA表达策略的多重因突变遗传病的基因疗法，并为全人类带来福祉。CRISPR/Cas9技术使细胞工厂构建过程中的菌株构目前，碱基编辑已成功在其他哺乳动物中用于疾

14第4卷www.synbioj.com081病治疗，并已被证明具有治疗人类单基因突变遗all'swellthatendswell[J].AnnualReviewofGenetics,2006,传病的潜力。2020年，Yeh等［129］通过双AAV递送40:363-383.[11]GAOCX.Genomeengineeringforcropimprovementandfu‐CBEMax系统成功治愈小鼠Tmc1基因隐性突变导tureagriculture[J].Cell,2021,184(6):1621-1635.致的耳聋，使其能够重新对中等程度的声音做出[12]CHANGHHY,PANNUNZIONR,ADACHIN,etal.Non-［130］反应。Wang等通过对β-地中海贫血和镰刀状homologousDNAendjoiningandalternativepathwaystodou‐贫血患者造血干细胞中的BCL11A增强子位点进行ble-strandbreakrepair[J].NatureReviewsMolecularCellBiol‐编辑或修复发生突变的HBB基因，以及进行自体ogy,2017,18(8):495-506.[13]RANFA,HSUPD,LINCY,etal.DoublenickingbyRNA-造血干细胞移植使其在体内分化产生正常的红细guidedCRISPRCas9forenhancedgenomeeditingspecificity[J].胞，从而治疗由β-globin珠蛋白突变引发的遗传Cell,2013,154(6):1380-1389.病。CRISPR作为近年来发展起来的新兴技术，在[14]RANFA,HSUPD,WRIGHTJ,etal.Genomeengineering为生命科学带来一系列革命性应用技术的同时，usingtheCRISPR-Cas9system[J].NatureProtocols,2013,还存在一些问题和困难，随着越来越多热忱的研8(11):2281-2308.[15]ZHUSY,LIW,LIUJZ,etal.Genome-scaledeletionscreen‐究者的加入，CRIPSR/Cas9系统的功能将会进一步ingofhumanlongnon-codingRNAsusingapaired-guide完善，这些阻碍与挑战也将被不断去除和攻破。RNACRISPR-Cas9library[J].NatureBiotechnology,2016,34(12):1279-1286.参考文献[16]PAQUETD,KWARTD,CHENA,etal.Efficientintroductionofspecifichomozygousandheterozygousmutationsusing[1]ISHINOY,SHINAGAWAH,MAKINOK,etal.NucleotideCRISPR/Cas9[J].Nature,2016,533(7601):125-129.sequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphatase[17]REIDERAPELA,D'ESPAUXL,WEHRSM,etal.ACas9-isozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofbasedtoolkittoprogramgeneexpressioninSaccharomycesthegeneproduct[J].JournalofBacteriology,1987,169(12):cerevisiae[J].NucleicAcidsResearch,2016,45(1):496-508.5429-5433.[18]MORENOAM,FUX,ZHUJ,etal.Insitugenetherapyvia[2]JANSENR,VANEMBDENJDA,GAASTRAW,etal.Iden‐AAV-CRISPR-Cas9-mediatedtargetedgeneregulation[J].MoltificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinpro‐Ther,2018,26(7):1818-1827.karyotes[J].MolecularMicrobiology,2002,43(6):1565-1575.[19]KLEINSTIVERBP,PREWMS,TSAISQ,etal.Engineered[3]BROUNSSJJ,JOREMM,LUNDGRENM,etal.SmallCRISPR-Cas9nucleaseswithalteredPAMspecificities[J].Na‐CRISPRRNAsguideantiviraldefenseinprokaryotes[J].Sci‐ture,2015,523(7561):481-485.ence,2008,321(5891):960-964.[20]HUJH,MILLERSM,GEURTSMH,etal.EvolvedCas9[4]CONGL,RANFA,COXD,etal.Multiplexgenomeengi‐variantswithbroadPAMcompatibilityandhighDNAspecific‐neeringusingCRISPR/Cassystems[J].Science,2013,339(6121):ity[J].Nature,2018,556(7699):57-63.819-823.[21]KOCAKDD,JOSEPHSEA,BHANDARKARV,etal.In‐[5]BARRANGOUR.CRISPR-CassystemsandRNA-guidedin‐creasingthespecificityofCRISPRsystemswithengineeredterference[J].WileyInterdisciplinaryReviews:RNA,2013,RNAsecondarystructures[J].NatureBiotechnology,2019,4(3):267-278.37(6):657-666.[6]SHMAKOVS,ABUDAYYEHOO,MAKAROVAKS,etal.[22]QILS,LARSONMH,GILBERTLA,etal.RepurposingDiscoveryandfunctionalcharacterizationofdiverseclass2CRISPRasanRNA-guidedplatformforsequence-specificCRISPR-cassystems[J].MolecularCell,2015,60(3):385-397.controlofgeneexpression[J].Cell,2013,152(5):1173-1183.[7]CHANDRASEGARANS,CARROLLD.Originsofprogram‐[23]PEREZ-PINERAP,KOCAKDD,VOCKLEYCM,etal.mablenucleasesforgenomeengineering[J].JournalofMolecu‐RNA-guidedgeneactivationbyCRISPR-Cas9-basedtranscrip‐larBiology,2016,428(5):963-989.tionfactors[J].NatureMethods,2013,10(10):973-976.[8]PORTEUSMH,CARROLLD.Genetargetingusingzincfin‐[24]MAEDERML,LINDERSJ,CASCIOVM,etal.CRISPRgernucleases[J].NatureBiotechnology,2005,23(8):967-973.RNA-guidedactivationofendogenoushumangenes[J].Nature[9]JOUNGJK,SANDERJD.TALENs:awidelyapplicableMethods,2013,10(10):977-979.technologyfortargetedgenomeediting[J].NatureReviews[25]NAKAMURAM,GAOYC,DOMINGUEZAA,etal.CRIS‐MolecularCellBiology,2013,14(1):49-55.PRtechnologiesforpreciseepigenomeediting[J].NatureCell[10]WYMANC,KANAARR.DNAdouble-strandbreakrepair:Biology,2021,23(1):11-22.

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