CRISPR_Cas系统的挖掘、改造与功能拓展_柳柯

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SyntheticBiologyJournal2023，4（1）：47-662023年第4卷第1期|www.synbioj.com特约评述DOI:10.12211/2096-8280.2021-022CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展柳柯，林桂虹，刘坤，周伟，王风清，魏东芝（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，鲁华生物技术研究所，上海200237）摘要：规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas）是一种微生物获得性免疫系统，自从证实其可用于基因编辑之后，迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力，为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力，快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而，CRISPR/Cas系统也有一些固有的问题，例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序（PAM）对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等，严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展，阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制，“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的Ⅱ类CRISPR/Cas系统，重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制，及其在结构改造和功能拓展等方面的新进展，同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述，例如CRISPR/CasФ和CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题，有力地拓展了其功能和适用性，势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。关键词：CRISPR/Cas；基因编辑；脱靶效应；PAM约束；Cas工程改造中图分类号：Q816文献标志码：AMining,engineeringandfunctionalexpansionofCRISPR/CassystemsLIUKe，LINGuihong，LIUKun，ZHOUWei，WANGFengqing，WEIDongzhi（StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering，NewworldInstituteofBiotechnology，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China）Abstract:Theclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)andCRISPR-associatedproteins(Cas)werederivedfromanacquiredimmunesysteminmicrobes.Sincetheirfunctionsongeneeditinghavebeenreported,theyhavebeenrapidlyusedtoenhanceourabilitytoedit,regulate,annotate,detect,andimageDNAandRNAfragmentsofvariousorganisms,whichconsequentlyhavefaciliatedfundamentalresearchinlifescience,收稿日期：2021-02-08修回日期：2021-04-28基金项目：国家自然科学基金（21978084）引用本文：柳柯，林桂虹，刘坤，周伟，王风清，魏东芝.CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展［J］.合成生物学，2023，4（1）：47-66Citation：LIUKe，LINGuihong，LIUKun，ZHOUWei，WANGFengqing，WEIDongzhi.Mining，engineeringandfunctionalexpansionofCRISPR/Cassystems［J］.SyntheticBiologyJournal，2023，4（1）：47-66

1048合成生物学第4卷medicine,bioengineeringandsoon,anddrivedthedevelopmentofsyntheticbiologyandotherdisciplines.However,CRISPR/Cassystemsalsohavesomeinherentdrawbacks,suchasoff-targeteffect,constraintofprotospacer-adjacentmotif(PAM)onthetarget,andcontrollabilityofthegeneeditingactivity,whichsubstantiallycompromisetheirapplicationsinhighlypreciseandcontrollablegeneediting.Inordertoovercomethesechallenges,twoimportantstrategieshavebeenemployedtodevelopenhancedCRISPR/CassystemsandexpandtheCRISPRtoolbox,includingmodifyingtheCasproteinsbyproteinengineeringandminingnovelCRISPR/Cassystemswithbioinformatics.Inthereview,focusingonthemostwidelyusedthetypeIICRISPR/Cassystems,wemainlyintroducethebasicstructuresandfunctionsofthreerepresentativesystems,includingCRISPR/Cas9,CRISPR/Cas12aandCRISPR/Cas13a,aswellasrecentprogressintheirstructuralmodificationsandfunctionalexpansion.Thereinto,engineeringstrategiesforCRISPR/Cassystemshavebeensystematicallycommented,whichincludemodificationmethodsforCasproteinsandthewaytoexpandthefunctionofCRISPR/CassystemsbycouplingspecficproteinswithCas.Inaddition,wealsoreviewsomenovelCRISPR/Cassystemswithimportantcharacteristicsandpotentialapplicationsthathavebeendiscoveredinrecentlyyears,suchasCRISPR/CasФandCRISPR/Cas12k.TheseengineeringmodificationsandminingworkhavegreatlyaddressedtheinherentproblemsoftheCRISPR/Cassystems,andeffectivelyexpandedtheirfunctionsandapplicability,whichwillfurtherpromotetheapplicationsoftheCRISPR/Cassystemsinmanyfields.Keywords:CRISPR/Cas;geneediting;off-targeteffect;PAMconstraints;CasengineeringCRISPR/Cas是一种协助细菌和古生菌抵御外蛋白）锚定入侵遗传物质，随后切离一部分称为来遗传元件入侵的适应性免疫系统，包含两个主前间隔序列（protospacer）的特定DNA序列，并要部分：由重复序列和间隔序列规律成簇排列形将其插入到两个重复序列之间，作为特定的间隔［1-3］成的CRISPR阵列和一系列CRISPR相关蛋白。序列；第二阶段，或称表达及加工阶段，由在生理上，这种微生物免疫系统发挥功能一般包CRISPR阵列转录为前体CRISPRRNA（简称pre-括3个阶段：第一阶段，又称适应阶段，由Cas蛋crRNA），随后由不同的Cas蛋白复合物（有时需白复合物（通常为CRISPR适应模块所编码的Cas要额外蛋白以及RNA分子的协助）加工成为成熟

2第4卷www.synbioj.com049的CRISPRRNAs（简称为crRNAs）；第三阶段，CRISPR/Cas工程系统始终是科研工作者所追求的或称为干扰阶段，加工成熟的crRNAs与Cas蛋白目标。本文着眼于近些年来CRISPR/Cas系统的相复合物结合并特异性靶向切割目标DNA或关发展，重点介绍了具有广泛应用价值的Ⅱ类［4-7］CRISPR/Cas系统的优化改造方法和相关进展，并RNA。正是基于这种独特的功能机制，CRISPR/Cas系统迅速发展成为了新一代基因编辑对新近发掘的具有重要特色和应用价值的CRISPR/工具，由于其易于设计、成本低廉、编辑效率高Cas系统进行了综述。这些工作显著提升了等优势，该工具一经出现就快速取代了锌指核酸CRISPR/Cas系统的功能，拓展了其应用价值，有［8］利于CRISPR/Cas系统在新领域的创新发展，也为酶（zincfingernucleases，ZFN）、转录激活样因子效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectors进一步改进拓展CRISPR/Cas系统指明了发展［9］方向。nuclease，TALEN）等传统基因编辑工具，形成了功能更为强大的基因编辑技术，并广泛应用于［10-12］［13-15］［16-17］基因调控、表观修饰、碱基编辑、基1CRISPR/Cas的分类［18-20］因成像等不同领域，且在微生物、植物、动［21-25］物甚至人体内表现出了广泛的适用性，强有力在长期进化过程中，CRISPR/Cas产生了多种地推动了基础生命科学、医学和生物工程等学科多样的组织形式和相应的Cas蛋白，对其进行清晰的快速发展，尤其是为合成生物学的突破式发展［46-47，55］的分类十分困难。目前，CRISPR/Cas系统提供了重要技术支撑。鉴于CRISPR/Cas系统对科已有2个大类（Ⅰ类和Ⅱ类）、5个小类和16个亚学与社会重要而深远的影响，其奠基人Jennifer［46，55］类，最近又新增了第6小类和3个新亚类。在Doudna和EmmanuelleCharpentier因此斩获了2020年已鉴定的CRISPR/Cas系统中，以Ⅰ类CRISPR/Cas［26］度的诺贝尔化学奖。为主，占比多达90%左右，广泛分布于细菌和古CRISPR/Cas系统的成功应用，激发了人们对生菌中，由于其效应复合物十分复杂，通常需要其更多的期待，因此CRISPR/Cas系统被不断地应4～7个Cas蛋白亚基，因此应用于基因编辑时实用用于疾病特异性检测、基因治疗和细胞功能精准［55］性往往不佳，使得编辑过程变得复杂烦琐。而调控等新领域。尽管相关工作已经取得了令世人相较于Ⅰ类系统，Ⅱ类CRISPR/Cas可以通过单个瞩目的成就，然而CRISPR/Cas系统固有的脱靶效多功能域的Cas蛋白发挥DNA或RNA的切割功应、PAM对可编辑基因的限定性和基因编辑活性能，因此Ⅱ类CRISPR/Cas系统易于设计改造，再的可控性等问题，严重影响了CRISPR/Cas系统在加上其能以双链断裂（double-strandbreaks，DSBs）应用过程中的精准性、灵活性、可控性和安全性，的方式高效切割靶核酸序列，故而Ⅱ类CRISPR/［27-31］阻碍了其功能和应用范围的进一步拓展。为了［55-58］Cas最早被开发并应用于基因编辑等工作。在解决这些难题，优化改造现有CRISPR/Cas系统和Ⅱ类CRISPR/Cas中，CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a发掘具有新颖功能特色的CRISPR/Cas新系统，就和CRISPR/Cas13a最具代表性，应用最为成功和广成为近些年来获得性能更优、用途更广的基因编泛，下面我们重点对这三种系统进行详细介绍。辑系统的重要策略。目前针对CRISPR/Cas系统常见的优化改造工作有：对向导RNA（guideRNA，1.1CRISPR/Cas9系统［32-33］gRNA）的优化设计，对Cas蛋白与向导RNA［34-36］浓度的优化，对Cas蛋白的工程化改Cas9是最早被发现和表征的Ⅱ类CRISPR/Cas［30-31，35，37-45］造等；而对于CRISPR/Cas新系统发效应蛋白，是目前应用最为广泛的Cas蛋白之掘，近几年也有许多重要的进展，发现了多种极［21，59-61］一。Cas9蛋白为二裂片结构，分为核酸酶具特色的新式CRISPR/Cas系统，包括Cas12a/b/c、叶（nucleaselobe，NUC）和识别叶（recognition［46-54］Cas13a/b/c、CasФ、Cas12k等。无论采用何种lobe，REC）两部分，两部分形成的中央通道可容方式，获得功能更加出色、应用范围更广的纳靶DNA和crRNA配对形成的异源双链核酸分

3050合成生物学第4卷［69］子，REC与gRNA的识别结合密切相关，而NUC重制约了其对基因组大部分位点的编辑；二是［61］则主要负责DNA链的切割。NUC可进一步划分脱靶效应，gRNA同靶结合区的结合可以容纳多达为HNH域、RuvC域、楔形域（wedgedomain，［27］7个碱基的错配，因而CRISPR/Cas9系统在基因WED）和PAM互作域（PAM-interactingdomains，组编辑过程中不可避免地会发生难以预测的脱靶PI），前两者分别用于切割靶DNA链和其互补链，现象。Fu等对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应进行产生平末端结构，PI则与PAM序列的识别与结合了评估，结果表明其脱靶率高达66%，这对于许有关。REC可继续划分为REC1、2、3域以及富含多需要对基因组进行精准编辑的工作来说是一个精氨酸的桥螺旋结构（bridgehelix，BH）［61-63］［27］严重的问题，例如在医学上用于基因治疗。因［图1（a）］。虽然许多Cas9蛋白的三维结构已经得此如何增强CRISPR/Cas9系统用于基因编辑的灵到了解析，但对于多个域的具体功能并未得到完活性和特异性是亟待解决的关键科学问全阐明，因而通过完全理性的方式来优化改造［28，33，69］题。除此之外，CRISPR/Cas9系统的有效［61-64］Cas9仍较为困难。传递方式、对部分序列编辑活性不足、Cas9蛋白在功能上，Cas9是一种由crRNA和反式激活［70-72］毒性等问题也对其应用有一定的限制。总的来crRNA（trans-activatingcrRNA，tracrRNA）引导说，对基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑工具的的DNA核酸内切酶，其发挥作用起始于CRISPR开发和应用，极大增强了科研工作者对于不同物阵列转录为pre-crRNA，随后tracrRNA与pre-种基因编辑的能力，但其相应的不足之处也十分crRNA的重复序列互补，并与Cas9蛋白结合在一明显。因此如何解决所面临的挑战，使其功能和［61，63］起形成RNA-蛋白复合体。接着，核糖核酸内适用性更加强大，值得继续深入研究。切酶RNaseⅢ对RNA-蛋白复合体上的pre-crRNA进行加工剪切，使其为成熟的crRNA。然后活性1.2CRISPR/Cas12a系统Cas9-RNA复合体扫描基因组3'端富含鸟嘌呤的PAM序列，并识别出与成熟crRNA互补的靶DNACas12a（先前称为Cpf1）是Ⅱ类Ⅴ型CRISPR/序列，之后在成熟的crRNA与靶DNA互补碱基配Cas的效应蛋白，也是目前应用最为广泛的Cas蛋［30，38，73-77］对的驱动下形成R环，Cas9蛋白的RuvC和HNH白之一。Cas12a蛋白同样为二裂片结构，活性域分别对靶向DNA链和非靶向DNA链进行切包括NUC叶和REC叶，NUC叶包括WED、PI、割，从而引发DNA双链断裂［61，63］［图1（d）］。基RuvC、BH和Nuc多个结构域，其中Nuc域为假定的于这种机制，人们设计开发了基于CRISPR/Cas9新型核酸酶结构域，用于切割靶DNA链［图1（b）］。的基因编辑工具，通过对靶基因的切割，就可以与Cas9蛋白不同，Nuc域行使切割功能的前提是利用非同源末端连接（non-homologousend-joining，RuvC域能够对靶DNA链的互补链进行切割，因此NHEJ）或同源重组（homologousrecombination，对于RuvC域活性残基的突变会直接破坏Cas12a蛋HR）等DNA修补机制，对目标靶点进行基因敲白对于双DNA链切割的能力。而Cas12a的REC叶除、整合、倒位、易位、单碱基突变以及基因表则仅包括两个区域，REC1域和REC2域，同样与［21，59-60，65-68］靶DNA的识别与结合有关［78-80］［图1（b）］。相较达抑制、激活、标记等编辑操作。这种基因编辑方法精准高效、易于设计、操作简单且于Cas9蛋白，Cas12a蛋白分子量要小一些，含在不同物种中均有良好表现，得到了快速的应用1200～1300个氨基酸，理论上更适合通过腺病毒推广，解决了先前许多物种基因组难于编辑的难相关载体（recombinantadeno-associatedvirusvectors，［70，78］题，成为近些年来生物技术发展一项重大成就。rAAV）的递送来介导动物细胞的基因编辑。但是Cas9也有一些不足之处：一是其识别的蛋白结构上的差异导致CRISPR/Cas12a与PAM序列为5'-NGG，该序列在许多低GC含量的CRISPR/Cas9在作用机制上有明显不同。主要有以基因组中出现的频率较低，例如在人类基因组中下三点：①Cas12a本身同时具有DNA和RNA内切平均每8个碱基才有可能出现1个PAM序列，这严酶活性，能够不依靠tracrRNA将前体crRNA加工

4第4卷www.synbioj.com051为成熟的crRNA；②Cas12a识别位于靶序列5'端富类似的PAM局限、脱靶效应等问题同样存在于含胸腺嘧啶的PAM序列；③Cas12a分别在靶DNACRISPR/Cas12a系统中，针对该系统的进一步优化的PAM序列下游第23位核苷酸和互补链的第18位完善，对于凸显Cas12a蛋白的优势、提高人们对基因的编辑能力十分必要，也会为我们提供更加核苷酸处进行切割，产生具有4～5bp的5'突出端［78，80］强大和多样化的基因编辑工具。的黏性末端［图1（d）］。高效的crRNA加工、独特的PAM识别序列以及黏性末端的产生使得1.3CRISPR/Cas13a系统CRISPR/Cas12a系统更有利于在富含AT且HR效率低的宿主中进行多重基因编辑，并在一定程度上与上述两种Cas蛋白不同，Cas13a（先前称为与CRISPR/Cas9系统在特点上形成了互补。然而，C2c2）是一种RNA引导的靶向RNA的核酸酶。这图1SpCas9、FnCas12a和LbaCas13a的结构组织和作用机制简图Fig.1SchematicdiagramsforthestructuresandworkingmechanismsofSpCas9,FnCas12aandLbaCas13a

5052合成生物学第4卷种Ⅱ类Ⅵ型CRISPR/Cas蛋白在识别单链靶RNA时EnzymaticReporterUnLOCKing），该平台通过核被激活，因此可用于编辑操纵另一类重要的遗传酸扩增和Cas13a介导的间接裂解报告RNA来检测［81-82］释放的报告信号，从而可用于实时检测如寨卡病物质——RNA。Cas13a的蛋白结构同样也采用双裂片形式，包括REC叶和NUC叶。其中N末毒、登革热病毒等特定生物的靶标RNA或DNA分［83，85］端域（N-terminaldomain，NTD）和螺旋域1构成子。类似的，Fozouni等开发了一种免扩增的REC叶，用于负责crRNA5'端的固定；而NUC叶CRISPR/Cas13a检测技术，可以在5min内直接从则由离散的高等真核生物和原核生物核苷酸结合一组鼻拭子样品中准确检测出SARS-CoV-2RNA，域1（highereukaryotesandprokaryotesnucleotide-且30min测量时间内即可达到大约100拷贝/mL的［86］binding，HEPN1）、螺旋域2、螺旋域3和HEPN2灵敏度。总的来说，对CRISPR/Cas13a系统的组成［图1（c）］，其中HEPN域的激活被认为与靶开发为RNA引导靶向RNA的技术打开了大门，该RNA的识别有关，并进一步驱动蛋白构象的变化，技术可通过对特定RNA转录物进行干扰、调节、［82］修饰和监测，使得我们能够感测不同的细胞状态，产生复合的RNA酶活性位点。然而由于Cas13a的HEPN域的激活机制尚未得到完全解释，使得基操纵翻译以及跟踪RNA水平和在活细胞中的定位，于Cas13a的RNA编辑工具的开发受到了限制。而有助于有效增进我们对RNA分子生物学的［47，87］鉴于Cas13a核酸酶家族在RNA检测以及可编码的理解。RNA结合（如dCas13a，拥有突变的HEPN域，仅保留靶向结合RNA能力，可用于活细胞的RNA成2CRISPR/Cas系统的改造［81］像等用途）方面有巨大的应用潜力，有必要针对该型Cas蛋白的功能机制进行进一步的深入研CRISPR/Cas系统在基因编辑、调控、检测等究，这将有助于推动Cas13a作为RNA编辑工具的方面所取得的巨大成就，使人们对其在不同领域［81-83］创新应用。的应用有了更多的期望和想象。然而，CRISPR/类似于其他Cas蛋白对靶基因PAM序列的识Cas系统一些固有的特点，限制了其应用范围。以别需求，大多数Cas13a对靶RNA的切割依赖于对普遍使用的CRISPR/Cas12a为例：对PAM序列3'H（A，U，C）前间隔侧翼序列（protospacerflankingTTTN的识别限制了靶序列的选取，因此无法自由sequence，PFS）的识别（来自于细菌Leptotrichia地对基因组不同位点进行操纵；严重的脱靶效应，［81］wadei的Cas13a是一个例外，不需要PFS）则极大限制了该系统对基因的精准编辑或操控；［图1（d）］。在准确识别PFS后，“crRNA-靶RNA”此外Cas12a等Cas蛋白分子量仍较大，不利于通过双链体结合在NUC叶带正电的中心通道中，同时［30，38，88］细胞递送来介导基因编辑等。诸如此类问Cas13a蛋白发生显著的构象变化，进一步激活题，使得CRISPR/Cas系统在医学、基因精准编程Cas13a蛋白HEPN域的催化位点，后者特异性切割等领域的进一步发展受到了严重的限制，因此通单链靶RNA的尿嘧啶碱基，同时活化的Cas13a蛋过改造CRISPR/Cas系统来创建“理想”的基因编白会延伸裂解附近非靶向RNAs，这称为附带效辑工具就成为当前的研究热点。下面我们着重介［81，84］应，该现象在真核生物细胞中尚未发现。与绍关于CRISPR/Cas系统的改造方法和一些突破性Cas12a类似，Cas13a自身也具有独立的RNA酶活的进展。性，能自主加工CRISPR阵列，因此可用于多重编辑多个RNA序列。另外，附带效应的存在使得2.1针对CRISPR/Cas系统自身的改造CRISPR/Cas13a系统可通过体内触发编程性的细胞死亡或者体外非特异性降解携带标记的RNA来检Cas蛋白作为CRISPR/Cas系统的核心元件之测特定RNA的存在。基于此，Gootenberg及其同一，其结构和作用机制在很大程度上决定了该系事设计了可体外检测amol/L级的DNA或RNA分子统的功能走向，因而针对Cas蛋白的工程化改造一的平台，称为SHERLOCK（SpecificHighSensitivity直是优化提升CRISPR/Cas系统的关键。

6第4卷www.synbioj.com053［90］非理性进化是对Cas蛋白进行工程改造的常用类基因组有强大的编辑能力。Gao等对源于氨基方法。该方法利用随机突变构建包含大量Cas突变酸球菌（Acidaminococcussp.）的Cas12a（AsCas12a）体的文库，然后通过有效的筛选策略，例如通过中靠近PAM双链序列识别域的60个氨基酸残基进Cas蛋白介导可诱导编码毒素基因的质粒切割的细行了盒式突变筛选，并将效果良好的单氨基酸突菌存活策略或基于人体细胞的EGFP报告基因干扰变点进行组合，最终获得了PAM识别序列分别为策略等，来获取正向有益突变，再进一步通过TYCV和TATV序列的RR（S542R/K607R）突变体组合有益突变来得到性能更佳的Cas突变体和RVR（S542R/K548V/N552R）突变体，在此基［73，89-91］（图2）。通过这种方式，Kleinstiver及其同础上，再引入K949A点突变来去除极性残基与靶事针对来源于金黄色葡萄球菌（StaphylococcusDNA之间的非特异性接触从而增强靶向特异性，aureus）的Cas9（SaCas9）进行了进化筛选，获得成功得到了既具有更大范围的PAM识别能力又具了可识别PAM为NNNRRT的SaCas9突变体，命名有更高保真性的突变体，这些突变也可直接用于为KKHSaCas9，该突变体对靶基因的识别能力在其他Cas12a蛋白的改造，例如来源于毛螺科菌［35，89］SaCas9（NNGRRT）的基础上扩展了2～4倍，对人Lachnospiraceaebacterium的LbCas12a。图2　基于非理性进化的Cas蛋白改造策略示意图Fig.2SchematicdiagramforrandommodificationsofCasproteins(TherandommodificationstrategyforCasproteinscontainsfollowingsteps:Firstly,randommutagenesis,suchasError-pronePCR,PACE,PANCE,etc,areemployedtogeneratevariantlibrariesofCasproteins.Secondly,effectiveassessments,suchasplasmidinterference-baseddepletionscreening,humancell-basedEGFPreporterassay,andsoon,areappliedtoscreenpositivemutations.Finally,thepositivemutationsarecombinedformutagenesistodevelopmoresignificantCasvariants.)

7054合成生物学第4卷值得一提的是，Hu和Miller等通过噬菌体辅问题，因此对Cas蛋白的理性改造也大多围绕着助的持续进化（PACE）方法，对SpCas9进行了进“提高靶向特异性”和“扩展对PAM序列的识别范化，筛选获得了PAM识别序列为NG、GAA和围”这两项内容展开。GAT的突变体xCas9，该突变体与野生型SpCas9相靶向特异性是CRISPR/Cas系统用于基因组精比具有更为扩展的PAM识别能力和全基因组范围准编辑的前提。在Cas蛋白中，REC域与gRNA的更低的脱靶率，这使得xCas9变体在人体细胞中应识别密切相关，因此是改造提升CRISPR/Cas系统［61，63，78，80］用于转录调控、基因敲除和单碱基编辑等的能力靶向特异性的重点区域。Chen及其同事［92］有了大幅提升；类似地，Miller及其同事又通过发现当Cas9识别与gRNA完全配对的靶基因时，噬菌体辅助非连续进化（PANCE）的方法和3种新REC3域能通过与RNA-DNA异源双链分子的相互的PACE筛选策略（即将SpCas9的进化轨迹分为3作用，使得Cas9的构象发生变化并进而使HNH域［94］个独立的方向，分别选择不含有鸟嘌呤的NAA、处于激活状态，从而介导准确的切除反应。据NAT和NAC这3种PAM序列，来筛选可识别非经此Chen通过组合突变REC3域的4个残基和HNH-典PAMs序列的SpCas9突变体），获得了能识别RuvC连接处的1个残基，成功改造出新的具有高PAM序列为NRNH（R是A和G，H是A、C和T）保真性的Cas9变体HypaCas9，该突变体包含的3个新颖SpCas9突变体，摆脱了SpCas9对含有N692A/M694A/Q695A/H698A四个点突变，在基因特定鸟嘌呤PAM序列识别的依赖，这3个新型编辑活性未发生明显变化的情况下，在人类基因［94］SpCas9变体与先前报道的SpCas9变体一起，原则组中的靶向特异性得到了显著的提升。除了上可以实现靶向大多数PAM序列为NR的基因，REC域外，Slaymaker和Gao等发现在SpCas9的显著扩展了CRISPR/Cas9系统对基因的靶向HNH域、RuvC域和PAM识别域之间有一个带正［93］能力。电荷的凹槽，可能与稳定靶DNA的互补链有关，随着人们对Cas蛋白三维结构和作用机制的深使该非靶向DNA链凹槽（nt-groove）中带的正电入认识，通过理性和半理性的方法对Cas蛋白进行荷残基中性化可能会增强Cas蛋白靶向DNA的特［35］工程化改造就逐渐成为一种优化提升CRISPR/Cas异性（图3）。因此Slaymaker和Gao等对非靶向系统的有力手段。该方法以Cas蛋白的结构特点和DNA链凹槽的31个带正电荷的残基进行了丙氨酸催化原理为指引，对Cas蛋白相应的结构域进行替换筛选，之后又对筛选位点进行了组合突变，设计改造，来筛选性能更为优异的Cas变获得了具有高保真性的Cas9突变体eSpCas9（1.0）［30-31，35，37-38，94-95］体。鉴于“脱靶效应”和“PAM约和eSpCas9（1.1），这两个突变体分别包含突变点束”是当前影响CRISPR/Cas系统应用发展的核心K810A/K1003A/R1060A和K848A/K1003A/R1060A。图3SpCas9解开靶DNA链双螺旋结构后DNA链与非靶向DNA链凹槽的电荷分布模型图［35］Fig.3ModelforchargedistributiononDNAandthent-grooveafterSpCas9unwindsthedoublehelixstructureoftargetedDNAstrands[35](PositivelychargedgroovesamongtheHNH(purple),RuvC(green),andPIdomains(gray)inSpCas9playakeyroleinstabilizingthenon-targetstrandofthetargetDNAbyDNAinteractions.Then,theSpCas9complexcanreadilytargetpairedDNAstrandsthroughcomplementationtodriveDNAunwindingandpreventre-hybridizationofDNAdoublestrands.)

8第4卷www.synbioj.com055相同的改造策略也成功应用于其他Cas9同系蛋白列进行识别的需求，即SpRY可以不受特定PAM［31］和Cas12a蛋白，例如SaCas9蛋白和AsCas12a，在的约束靶向基因组的任何位点进行编辑。在不改变Cas核酸酶活性的同时，均显著提升了CasSpRY的基础上，另外再引入类似于构建SpCas9-［35，89］蛋白靶向基因的特异性。类似的，KleinstiverHF1的氨基酸突变，可以进一步提高其靶向特异及其同事通过分析SpCas9-sgRNA-靶DNA复合物，性，这说明通过蛋白质工程改造获得的SpRY具有发现SpCas9有4个残基（N497、R661、Q695、Q926）直极其优异的性能，可进一步拓展其在基因精准编接与靶DNA链的磷酸骨架形成氢键，推测可通过辑方面的灵活性和特异性，这对于现有的Cas基因减少SpCas9蛋白与靶DNA位点的非特异性相互作编辑工具库而言是个极其重要的扩充，拥有巨大用使SpCas9的脱靶效应最小化，故而构建了15个的开发潜力。包含有N497A、R661A、Q695A和Q926A组合突变此外，对减少Cas12a的PAM约束性同样也有体文库，最终确认包含N497A、R661A、Q695A很大的突破，Kleinstiver及其同事通过把可能改变和Q926A全部4个突变点的SpCas9变体SpCas9-或形成新的PAM近端DNA相互作用的氨基酸突变HF1拥有最好的全基因组编辑特异性并保有较高的为带正电荷的精氨酸，经过单个氨基酸置换或组合［95］靶向切割活性。值得一提的是，上述这些高保突变后获得了enAsCas12a（E174R/S542R/K548R），真Cas9变体的构建策略迥异，变体之间还缺少在该突变体能靶向许多PAM序列包括TTYN（TT［28，96］同一标准化应用场景下的并行比较，哪一种TN/TTCN）、VTTV（ATTV/CTTV/GTTV）、TRTV变体的应用效果更佳还需进一步评估。更为重要（TATV/TGTV）等，相较于野生型AsCas12a，其靶的是，能否对这些变体进行组合形成保真性更高向范围扩大了约7倍；另一方面通过引入类似于构的Cas9变体还值得进一步研究。建SpCas9-HF1的氨基酸突变，得到兼具高保真性［30］另外，对Cas蛋白可识别的PAM序列进行扩展，的突变体enAsCas12a-HF1（enAsCas12a+N282A）。增加可识别的PAM序列在目标基因组中的概率，是评估表明，enAsCas12a可提高各种基于Cas12a的解除PAM束缚，扩大CRISPR/Cas系统编辑能力的关应用效率，包括基因编辑、表观遗传修饰以及单键。Walton及其同事以SpCas9的变体SpCas9-VRQR碱基编辑等，是一款功能出色的Cas工具。类似为基础，通过以结构为指导的工程化改造策略，联合地，Toth及其同事对AsCas12a的突变体RRAsCas12a高通量PAM测定分析法（HT-PAMDA），获得了和RVRAsCas12a中用于改变PAM识别序列的突变PAM识别序列为NGN的突变体——SpG（D1135L/点进行了组合突变，获得了可识别TNTN、TACV、S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337R），并通过TTCV、CTCV和CCCV等PAM序列的新AsCas12a［30，38］结构分析发现将R1333替换为谷氨酰胺，可能使变体LbCas12a-RVRR。值得一提的是，该SpG识别的PAM由NGN变为NAN，因此在SpG的Cas12a变体在功能上虽然与enAsCas12a有部分重基础上，进一步联合突变R1333Q、L1111R、叠，但仍具有不同的靶标和PAM偏好性，因而两A1322R以及PI结合域的正电荷残基，获得了可识者可以很好地相互补充，可进一步扩大Cas12a的［38］别PAM序列为NRN（R为A/G）和NYN（Y为适用范围。C/T）的突变体——SpRY（SpG+L1111R/A1322R/除了对Cas蛋白进行优化改造外，Cho等发现［31］R1333P/A61R/N1317R）。分析表明SpRY不仅能也可以通过选择特定的靶标序列并优化gRNA和够有效靶向编辑大多数带有NRN序列的靶基因，Cas9蛋白的浓度来调整CRISPR/Cas系统的特异也能够对带有NYN序列的靶基因进行编辑，尽管性，降低脱靶效应；此外，gRNA的碱基组成和结其平均编辑能力约为前者的一半，但相较于无法构也会影响Cas9蛋白的活性，如在gRNA的5′末编辑PAM为NYN的靶基因的野生型SpCas9，端添加两个鸟嘌呤核苷酸可以使Cas9蛋白更具特［33］SpRY对PAM序列的兼容性有了大幅提高，NRN异性，进而减少脱靶效应。而Zetche及其同事和NYN的组合涵盖了大多数的PAM序列，这意味则另辟蹊径，根据与sgRNA和互补靶DNA结合的着SpRY变体在一定程度上摆脱了对特定PAM序Cas9晶体结构，将Cas9蛋白分成两个片段，分别

9056合成生物学第4卷与雷帕霉素敏感的二聚化结构域进行融合，在雷帕2.2复合CRISPR/Cas系统的创建霉素存在的条件下，Cas9的这两个片段可发生重组对于CRISPR/Cas系统的优化提升，除了改造恢复Cas9的完整结构，通过这种双分子诱导互补的CRISPR/Cas自身之外，还可以通过外源蛋白结构方式，Zetche等可以实时控制Cas9的编辑活性，域的引入，来创建具有复合功能的CRISPR/Cas系不仅可以减少脱靶效应，而且可以降低Cas9蛋白对［72］统，这是该系统创新发展的另一个重要方向。［34］细胞的毒性。Gao及其同事则通过使用具有双在Cas蛋白的基础上引入外源蛋白结构域进行融RNA聚合酶（PolⅡ和PolⅢ）活性的H1启动子来合，既可以优化提升CRISPR/Cas系统的各项性同时表达gRNA和Cas9蛋白，开发设计了单启动子能，又能创新性地开拓CRISPR/Cas系统更多的应［36］驱动CRISPR/Cas的表达系统。相较于传统的双用场景。例如对CRISPR/Cas系统靶向特异性的改启动子表达系统（具有PolⅢ活性的启动子用于造，一个典型的例子是Guilinger等通过融合催化gRNA的表达，具有PolⅡ活性的启动子用于Cas蛋失活的dCas9蛋白和FokI限制性核酸内切酶的切割白的表达），单启动子表达系统更为精简，利于通［64］域来提高基因组编辑的特异性。其设计原理是，过病毒载体进行转运，同时该系统表达的gRNA和在靶基因的上下游相向方向上设计两个相邻的Cas9浓度不高，理论上毒性和脱靶率也会更低。gRNA结合位点，在两个gRNA引导之下，FokI-当然，无论是通过针对Cas蛋白自身结构的优dCas9蛋白复合物靶向结合目的基因序列，由于单化改造，还是采用优化设计gRNA等方式，均能在个的FokI核酸酶切割域没有催化活性，只有相邻一定程度上提升CRISPR/Cas系统的应用性能。但两个gRNA结合位点同时结合FokI-dCas9单体时，由于不同实验室对于基因编辑效果的评判方式存才能装配出具有催化活性的FokI核酸酶二聚体，在差异，如Cas蛋白的种类、细胞株的种类、检测进而触发DNA双链的切割。由于相邻两个位点同方式以及靶基因的位置等，因此很难直接对上述时发生脱靶事件的概率要比单个位点的脱靶事件［28］这些工作的效果进行并行比较。为了确定各种的小得多，故而可显著提高CRISPR/Cas系统对基CRISPR/Cas系统及优化改造后的实际效果，需要因编辑的特异性［64］（图4）。建立一套标准通用的评估方案，任何与标准流程更为重要的是，外源蛋白结构域的引入还可有偏差的地方均需要重新评估，严格确定各类策为CRISPR/Cas系统带来崭新的功能。例如Zhou等［28］略的有效性。总而言之，上述这些工作对于改把可光解聚的二聚体绿色荧光蛋白pdDronpa与造CRISPR/Cas系统是极为有效的，对于我们加深Cas9融合，设计出了具有光控功能的Cas9蛋白ps-对CRISPR/Cas作用机制的理解、开发更加高效的［97］Cas9。在黑暗状态下，pdDronpa蛋白结构域二基因编辑工具有重要的指导意义。聚化封闭了核酸酶叶NUC和识别叶REC之间的图4FokI-dCas9融合蛋白变体的结构及功能示意图［64］Fig.4SchematicdiagramforthestructureandfunctionofFokI-dCas9fusionproteinvariants[64](TwodistinctFokInuclease(bluegrey)-dCas9(green)complexeswithsgRNA(black)bindtoadjacenttargetsiteswithparticularspacingconstraints,anddsDNAcleavagecanbetriggeredonlywhenthetwoFokI-dCas9complexesassembleadimericactiveFokInuclease.)

10第4卷www.synbioj.com057“裂缝”，阻碍了与靶DNA的结合，从而使ps-Cas9建了可实现胞嘧啶到腺嘌呤和胞嘧啶到鸟嘌呤碱蛋白处于“关闭”的状态；而在青光照射下，基替换的糖基化酶碱基编辑器（glycosylasebasepdDronpa蛋白结构域解聚为单体，可解除对ps-editors，GBEs），该碱基编辑器由Cas9切口酶、Cas9蛋白的封闭，允许其与靶DNA的结合，从而胞苷脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基酶三部分组成，其使ps-Cas9蛋白处于“开启”状态。通过这种方中Cas9切口酶负责靶向切割DNA单链，胞苷脱氨［97］酶负责催化胞苷发生不可逆的脱氨反应，产生尿式，Zhou等成功实现了对多种Cas9蛋白以及功能变体的融合改造，与先前的光遗传学方法相嘧啶，而尿嘧啶DNA糖基酶则切除尿嘧啶，防止比，这种Cas9复合体可更好地介导转录激活，并尿嘧啶被胸腺嘧啶替代，并形成起始DNA修复过能通过光诱导在同一细胞中同时实现对一个基因程的无嘌呤嘧啶位点。通过糖基化酶碱基编辑器，［99］的转录与另一个基因的编辑。显而易见，新蛋白Zhao等分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中实现功能域的引入，使得CRISPR/Cas系统的功能更加了胞嘧啶C到腺嘌呤A和胞嘧啶C到鸟嘌呤G的碱多样化，可创新性地拓展其应用场景，例如Steven基替换，进一步扩增了碱基编辑工具箱的多样性。［18］总的来说，通过其他蛋白结构域的引入来拓展等通过将eGFP/mRuby2融合到dCas9蛋白上，从而可使本氏烟草活叶细胞中端粒重复序列可视CRISPR/Cas系统的应用价值，目前已经取得了许化，证明可以通过融合荧光蛋白与dCas9，开发出多突破性的进展，只要想象力足够丰富，相信针对新型复合CRISPR/Cas系统的开发还有更多发展一种具有活细胞成像功能的复合CRISPR/dCas9系的空间。统，可应用于成像多个基因座位点以及可视化体内DNA和蛋白质的相互作用等。采用类似技术，［20］Zhou等基于基因组中大量可特异性标记的基因3新型CRISPR/Cas系统的发掘序列，针对染色体非重复区域设计了大量的sgRNAs，这使得能够在活细胞中对整个染色体进尽管通过工程化改造，可以显著提升CRISPR/行荧光成像，进而实现了对同源染色体和姐妹染Cas系统的应用属性、拓展其应用空间。然而，现色单体空间排列的成像，并由此可追踪分裂细胞有CRISPR/Cas系统的多样性仍有限，在一些特定中特定染色体的运动。除此之外，在Cas蛋白的基应用场景下，仍有一些固有的应用局限，例如现础上，引入胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶可用于单碱有的Cas蛋白尺寸过大，很难采用Cas蛋白人工递［16］［15］基编辑，引入乙酰转移酶可用于表观修饰，送的方式来编辑细胞内的靶基因，再例如把Cas蛋［12］引入转录激活域或阻遏域可用于转录调控等，白与一些其他蛋白结构域进行融合并不总是有效，这些复合CRISPR/Cas9系统的创建，极大拓展了这既涉及Cas蛋白的适用性，又事关融合后蛋白间CRISPR/Cas系统的功能多样性和应用场景。如的适配性。因此如何有效解决这些问题，也是当［98］Wang等开发了一款可用于同时调控多基因表达前的一个研究热点，其中从自然界发掘新型的基因编辑策略，称为BETTER（baseeditor-CRISPR/Cas系统，就是一个十分重要的研究方向。targetedandtemplate-freeexpressionregulation），该在长期与外来遗传元件进行“军备竞赛”的策略通过在所感兴趣基因上游的翻译或转录元件过程中，CRISPR/Cas系统通过完整的基因座或者处（核糖体结合位点，5′非编码区和启动子）插入单个功能模块的水平转移，实现了快速进化，这定制的翻译或转录元件序列，如GGGGGGGG、就导致了CRISPR/Cas系统在结构与功能上具有极CCCCCC等，再利用CRISPR引导的碱基编辑器的［46，49］高的多样性。当前，CRISPR/Cas系统的多样多重编辑和可调控编辑范围的能力，在不需要文性尚未得到充分的开发，如果能充分利用CRISPR/库构建、转化以及供体DNA并入的情况下，通过Cas的多样性，发掘新颖的结构和功能，这对于弥碱基编辑就可以在定制的翻译或转录元件序列原补现在CRISPR/Cas系统的不足、拓展CRISPR/Cas位处大量生成多样化的遗传组合，进而实现同时系统的应用潜力将具有重要的意义。一般而言，［99］大规模地调控多基因表达的目的。而Zhao等构对于CRISPR/Cas系统的发掘，多依赖于生物信息

11058合成生物学第4卷学的方法，即以CRISPR/Cas系统所应具有的特征CRISPR/Cas系统的工作流程，该流程以Cas1蛋白为指标，通过在基因组数据中检索具有疑似结构和CRISPR阵列作为种子对已有测序信息的细菌或特征的基因座，来预测鉴定可能的CRISPR/Cas新古生菌进行了全面分析，首先通过PILER-CR和系统，具体方法有两种：一是以CRISPR阵列的结CRISPRfinder的检索分析汇总出了一个CRISPR/构特征为检索手段，CRISPR阵列结构中最为明显Cas集合，然后通过Cas蛋白图谱搜索过滤掉属于的特征是连续相同并且具有回文性质的重复序列，已知CRISPR/Cas亚型的所有基因座，在剩余的［4］该序列长度通常为24～47bp不等，因此对于重Cas1和CRISPR邻近区域中，通过最敏感的域检测复序列超过48bp或者低于5bp的CRISPR疑似阵手段，如HHpred，对那些编码>500个氨基酸的蛋列基本可以予以排除；此外，在CRISPR/Cas基因白进行详细分析，来确定哪些可能是存在的新型［47］座中，第一个重复序列的5′上游区域通常包含一段CRISPR/Cas系统。通过这种方法，Shmakov等富含AT碱基的前导序列，对于前导序列的多序列发现了6种新型的CRISPR/Cas亚型，包括Ⅴ-B、［4］比对也是预测CRISPR阵列的常见方式。随着基Ⅴ-C、Ⅴ-U、Ⅵ-A、Ⅵ-B以及Ⅵ-C，其中部分系因组数据和大数据分析能力的快速发展，已有多统已被确证具有前所未有的功能特征，还有一些种以CRISPR阵列特征检索为主要分析手段的未被表征的亚型，如Ⅴ-U，其Cas蛋白也可能具有CRISPR/Cas预测挖掘工具，例如CRISPRdigger、一些独特的性质。这项工作在一定程度上揭示了［100-102］CRISPRFinder、CRT等。二是以Cas蛋白的来自于移动遗传元件的Ⅱ类CRISPR/Cas系统可能［47］检索为主要手段，在不同类型的CRISPR/Cas系统具有独立的进化起源过程。显然，这方面的工中，目前被广泛研究的Cas蛋白已有13种，其中作说明在自然界还存在大量功能独特的CRISPR/编码Cas1～Cas6的6种Cas基因与大多数Cas亚型Cas有待挖掘和开发，随着生物信息学等挖掘技术基因均有关联，被认为是Cas基因中的核心基因，的进步，CRISPR/Cas系统的家族会不断得到壮大，而在这些核心基因中Cas1又被认为是CRISPR基因这将进一步拓展CRISPR/Cas系统的功能边界和应座的标志性保守基因，因此常被作为鉴定候选用范围。［46］CRISPR/Cas基因座的基点。除此之外，基于已最近，Pausch等在新型CRISPR/Cas系统的挖知的Cas蛋白序列来构建模型，描述其遗传结构以掘方面取得了一个重大进展，他们表征了一种仅及蛋白数量，并进一步通过序列相似性比对来分存在于巨大噬菌体基因组中的超紧密型CRISPR/析预测可能的CRISPR/Cas系统，也是常见的以Cas系统——CRISPR/CasФ（Cas12j），该系统包括［103］Cas蛋白为检索手段的挖掘流程。当前，在Cas一个仅有70～80kDa的Cas蛋白——CasФ，仅为蛋白检索中MacSyFinder（MacromolecularSystemCas9和Cas12a蛋白尺寸的一半左右，是目前已表［48］Finder）是一种十分有力的工具，该程序基于隐马征的最小Cas蛋白。在作用机制上，CasФ类似尔可夫模型（HiddenMarkovModels，HMM）以于Cas12a，不需要tracrRNA，通过单个RuvC活性及确定成分的遗传组成和组织模型来对Cas蛋白质位点来介导crRNA的加工成熟，并以TBN（B为的相似性进行检索。另外，HMMCAS也是一种可G/T/C）为识别的PAM序列来靶向切割双链DNA［103-104］以在线查询以及预测Cas蛋白的有效工具。分子。该系统已被证实在体外、人体细胞以及植通过对上述两种检索分析手段的结合，Couvin物细胞中均具有编辑活性，尤其引人注目的是，等开发了一种更为强大的CRISPR/Cas预测工具——由于CasФ蛋白较小，能以核糖核蛋白（RNPs）的［48］CRISPRCasFinder，该程序不仅具有改进的形式递送到植物细胞中进行内源性基因编辑。CRISPR阵列检测系统，还拥有Cas蛋白检测以及在CasФ出现之前，Cas9和Cas12a等Cas蛋白由于分型系统，且可以预测CRISPR的方向，是一款极分子量过大而难以从细胞外向细胞内递送，为了其方便且准确的CRISPR/Cas分析预测工具，有助解决此问题，人们通常通过删减Cas蛋白的冗余结［105］于新型CRISPR/Cas系统的高效挖掘。基于类构域来精简Cas蛋白，然而这种蛋白质工程手段往［39，63，106-107］似思路，Shmakov等设计开发了一条发现新型Ⅱ类往会造成Cas蛋白活性的严重下降。例

12第4卷www.synbioj.com059如对SpCas9蛋白的精简改造，删减其REC2的突变菌霍曼氏胞菌的CRISPR相关转座酶——ShCAST，体（△REC2）仅能保留相较于野生型SpCas9蛋白它包括Tn7样转座酶亚基和Ⅴ-K型CRISPR效应蛋一半左右的活性，而△REC3的突变体其活性降低白（Cas12k）两部分，ShCAST通过sgRNA引导约1000倍，△REC1的突变体则完全无活性，同样在PAM序列下游60～66bp处转座插入目的DNA类似的情况也见于针对Cas12a蛋白的相关研片段（图5）。分析表明该系统在大肠杆菌基因组［63，106，107］究。显然，通过蛋白精简的方式，来构部分位点上的整合效率高达80%，显然这项工作建便于递送的Cas蛋白并不是一种有效的策略，小极大地提高了我们对于CRISPR/Cas系统功能多样而功能齐全的CasФ蛋白的出现为这一问题提供了性的认识，并且在生物学上首次通过天然的一种新的解决方案，CasФ拥有目前其他各种CasCRISPR/Cas转座实现了基因在基因组上整合，而［50］蛋白无法比拟的最小的功能性结构域，同时能有无需同源重组或者非同源末端机制的介入。类效进行基因组编辑以及DNA检测。然而，Pausch似地，Klompe等描述了一种源于霍乱弧菌在对人体细胞EGFP报告基因的干扰测试中，发现（VibriocholeraeTn6677）的CRISPR/Cas系统以及CasФ-2仅能编辑33%的细胞，工作效率不足，但相应的转座蛋白，也成功在大肠杆菌中实现了靶［108］Cas9在早期的工作效率也并不比CasФ-2高许向转座介导的DNA片段整合。［48］多，这意味着可通过进一步的优化改造来提高除了上述这些新式CRISPR/Cas系统外，CRISPR/CasФ系统的编辑活力和工作效率，这无Cas12b、Cas12c、Cas12e（CasX）等一些具有新疑具有重要的研究价值和实用意义。颖结构和功能的Cas效应蛋白近些年来也陆续被揭［54，109］最近，Strecker等发现了一种源于蓝细菌霍曼示出来。例如Yang及其同事鉴定了来源于脂氏胞菌（Scytonemahofmanni）镶嵌在Tn7样转座环酸杆菌（Alicyclobacillusacidoterrestris）的C2c1因子内的CRISPR/Cas12k系统（先前称为C2c5，（AacC2c1）和sgRNA二元复合物的晶体结构，并属于Ⅴ-U5型），该系统没有额外的类似于CRISPR/通过结合靶DNA成功捕获到了AacC2c1的催化活Cas适应模块的其他Cas基因，需借助于转座子来介性构象，阐释了AacC2c1识别富含胸腺嘧啶型导其正常的CRISPR/Cas功能，也就是说CRISPR/PAM序列的机制，分析表明该Cas蛋白不具有自Cas12k系统是通过直接整合到其他可移动的遗传主的CRISPR阵列加工能力，需要在crRNA和元件中来增强转座子的可移动性以及减小对宿主tracrRNA的协同下由单个RuvC核酸域靶向切割双［109］的破坏，进而为宿主转座子提供生物学上的优链DNA，进而产生黏性末端。对于这些新型［50］势。基于此，Strecker等成功表征了来自于蓝细Cas蛋白的鉴定和催化机制解析，显然扩展了图5ShCAST所介导的DNA转座模型［50］Fig.5ModelforShCAST-mediatedDNAtransposition[50](TheShCASTconsistsofaTn7-liketransposase(blue)andaCas12kprotein(green),whichcatalyzessgRNA-guidedDNAtransposition.ThecargogenebetweentransposonLEandREsequencescanbeinsertedintoDNAat60～66bpdownstreamofPAM.)

13060合成生物学第4卷CRISPR/Cas系统的多样性，其重要意义在于：一样性挖掘新式CRISPR/Cas系统”是当前人们所采方面加深了我们对CRISPR/Cas系统作用机制以及用的两种最为重要的策略。“对现有系统的优化改功能多样性的认识，使我们能够更好地理解造”主要是指对现有CRISPR/Cas系统的不足之处CRISPR/Cas系统的生物学意义和进化过程；另一进行改造提升，包括对Cas蛋白的优化改造以及通方面这些新系统为后续开发新式CRISPR/Cas工具过其他蛋白结构域的引入来创建具有新式功能的打下了良好的基础，对改善现有CRISPR/Cas系统复合型Cas蛋白变体。在Cas蛋白改造方面，近些的PAM局限、靶向方式、特异性和适用性等具有年来取得了许多重大进展，出现了一些工作性能重要的意义。得到显著提升的Cas蛋白突变体，例如SpCas9-HF1、SpRY、enAsCas12a等，这些Cas变体无论是在靶向特异性还是在拓宽PAM识别范围等方面都4总结与展望有了明显改善（表1）。这些成果也显著提高了我们对CRISPR/Cas系统作用机制的理解，例如对CRISPR/Cas系统易于设计、操作简便、精准Cas蛋白REC域的优化改造可以降低脱靶效应，对高效、使用成本低且在不同生物体具有良好的适PI结合域以及WED域的优化改造可拓宽PAM序列用性，这就使得该系统用于基因编辑具有其他技的识别范围，对Nuc域的突变可能会降低靶向活性术无可比拟的优势，因此该系统用于基因编辑的等等。在复合型Cas蛋白创建方面，这些的研究成功能一经揭示就迅速得到了全球关注，并广泛应果更加斐然，通过一些外源蛋白结构域的引入极用，成为了大多数生物学实验室的底层支撑技为有效地扩展了CRISPR/Cas系统的功能和应用属［110］术。然而，CRISPR/Cas系统的进一步发展还需性，例如复合型Cas变体已创造性地应用于基因成要解决诸如脱靶效应和PAM约束等问题。为了解像、定向进化、随机诱变、单碱基编辑等领域，决这些问题，“对现有的CRISPR/Cas系统进行优极大地拓展了CRISPR/Cas系统的应用场景。而化改造”以及“利用自然界CRISPR/Cas系统的多“对新系统的挖掘”则主要针对的是从自然界鉴定表1　工程化改造的Cas蛋白变体Table1EngineeredCasproteinvariants参考Cas蛋白变体突变点PAM序列保真性文献KKHSaCas9E782K/N968K/R1015HNNNRRT—[75]RRAsCas12aS542R/K607RTYCV—[74]RVRAsCas12aS542R/K548V/N552RTATV—[74]xCas9-3.7A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I/E1219VNG/NNG/GAA/GAT/CAA提高[77]SpCas9-NRRH/NRTH/NRCH—NRNH提高[78]HypaCas9N692A/M694A/Q695A/H698ANGG提高[79]eSpCas9（1.0）K810A/K1003A/R1060ANGG提高[35]SpCas9-HF1N497A/R661A/Q695AQ926ANGG提高[80]SpGD1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337RNGN—[31]SpRYSpG突变点+L1111R/A1322R/R1333P/A61R/N1317RNYN/NRN—[31]enAsCas12a-HF1E174R/S542R/K548R/N282ATTYN/VTTV/TRTV提高[30]LbCas12a-RVRRG532R/K538V/Y542R/K595RTNTN/TACV/TTCV/CTCV/CCCV—[38]BlackjackSpCas9—NGG提高[37]Note:Fromlefttoright,theCasproteinvariantsrepresentthosewithenhancedperformance;themutationpointsrepresentthecombinationofaminoacidmutationsoccurredintheCasvariants;thePAMsequencesrepresenttherecognizablePAMsequencesofthecorrespondingCasvariants;fidelityrepresentswhetherthevariantshaveimprovedtargetingspecificity;“—”representsnodataforthefidelityoftheCasvariantsinthecorrespondingreference.

14第4卷www.synbioj.com061发掘未知的CRISPR/Cas系统，Shmakov等的工作统，来加深我们对该系统及其功能多样性的认识，表明CRISPR/Cas系统具有高度的多样性，自然界从而为新功能新应用的拓展提供思路。此外，我存在大量未经鉴定的新型CRISPR/Cas系统，对这们还可以根据工作目的的不同，充分利用CRISPR/些新系统的挖掘鉴定和改造，势必会发现众多具Cas系统的不同特点，开发新用途。例如，脱靶效有新功能新特色的CRISPR/Cas系统，有助于进一应对于基因的精准编辑来讲是一个严重缺陷，但步扩大该系统的应用价值（表2）。值得关注的是，对微生物基因组的突变进化来说，却是一可供利［29，111］近两年人们发现了一些具有独特结构和功能的用的特点。Wang等发现在某些情况下CRISPR/Cas系统，例如CRISPR/CasФ和CRISPR/CRISPR/Cas9以及CRISPR/Cpf1系统具有超脱靶现Cas12k，前者有着最小化的功能性Cas蛋白，在细象，利用这种现象，可以开发类似于诱变育种功［112］胞递送方面上尽显优势，后者则摆脱了对同源重能的编辑工具。类似地，Kiga及其同事利用组与非同源末端连接等机制的依赖，可依靠转座CRISPR/Cas13a可以降解细菌RNAs进而抑制微生子来介导基因的整合重组。显而易见，对这些新物生长的特性，开发了基于CRISPR/Cas13a的抗菌型Cas蛋白的工程化改造，势必会进一步开拓核衣壳，能够通过识别相应的抗生素耐药基因，CRISPR/Cas系统的应用领域。来对耐受碳青霉烯的大肠杆菌和耐受甲氧西林的需要指出的是，虽然通过结构改造可以改变金黄色葡萄球菌进行序列特异性杀伤，并且具有Cas蛋白识别的PAM序列并降低其脱靶效应，但作为耐药细菌的治疗剂和检测细菌特定基因的潜Cas蛋白对PAM序列的识别调控机制以及脱靶效力。如果能在“现有系统优化改造”和“新系统应发生的机理尚未得到完全阐明，这就限制了以挖掘”等方面继续取得突破性进展，并充分利用结构和反应机制为基础的对Cas蛋白的优化改造。不同的CRISPR/Cas系统的功能特点，设计开发出此外，对于复合Cas蛋白的开发，虽然外源蛋白结具有创新应用场景的CRISPR/Cas工具，CRISPR/构域的引入可以提供新的功能，但也可能影响CasCas系统势必会有更广阔的发展空间。蛋白的靶标范围以及靶向结合能力。因此，为了总而言之，对CRISPR/Cas系统创新性的设计推动CRISPR/Cas系统的创新发展，一方面我们需开发，引发了基因编辑技术突破性的发展，极大要建立更加详细的Cas蛋白及其与靶核酸序列的作地提高了我们对基因进行编辑和操控的能力和效用模型，进一步解析CRISPR/Cas系统的作用机率，进一步加深了我们对基础生命科学的认识和制，为该系统的改造和功能拓展提供理论支持；理解、促进了医学和生物工程等研究领域的高速另一方面还需要通过不断挖掘CRISPR/Cas新系发展，尤其是对合成生物学的崛起这些CRISPR/表2　新型的Cas蛋白Table2NovelCasproteinsCas蛋白靶向核酸类型CRISPR阵列加工PAM/PFS切割后的DNA末端参考文献Cas12bdsDNA无富含T的PAM黏性末端[109]Cas12cdsDNA无——[47]Cas12ddsDNA无富含T的PAM—[54]Cas12edsDNA无富含T的PAM—[54]CasФdsDNA无TBN黏性末端[48]Cas12kdsDNA无GTN仅靶向不切割[50]Cas13bssRNA是5′DPFS3′NAN/NNAssRNA以及邻近的RNA[47]Cas13cssRNA无——[47]Note:Fromlefttoright,theCasproteinsrepresentthosenovelones;thetargetnucleasetypesrepresentthosetargetedbyCasproteins;theCRISPRarrayprocessingrepresentswhetherCasproteinshavetheabilitytoprocessCRISPRarrays;thePAM/PFSrepresentstherecognizablePAM/PFSsequencesofthecorrespondingCasprotein;ThetargetcleavagepatternrepresentstheformofnucleicacidendcleavagedbyCasprotein;“—”representsnodata.

15062合成生物学第4卷Cas系统提供了巨大的推动力，开创了一个崭新的[12]LIANJZ,HAMEDIRADM,HUSM,etal.Combinatorial生命科学时代。随着新式CRISPR/Cas的不断发掘metabolicengineeringusinganorthogonaltri-functionalCRIS‐及新型CRISPR/Cas系统的不断创造，我们有理由PRsystem[J].NatureCommunications,2017,8:1688.[13]KANGJG,PARKJS,KOJH,etal.Regulationofgeneex‐相信，基于CRISPR/Cas系统的科学研究未来会更pressionbyalteredpromotermethylationusingaCRISPR/加辉煌！Cas9-mediatedepigeneticeditingsystem[J].ScientificReports,2019,9:11960.参考文献[14]THAKOREPI,BLACKJB,HILTONIB,etal.Editingtheepigenome:technologiesforprogrammabletranscriptionand[1]MARRAFFINILA.CRISPR-Casimmunityinprokaryotes[J].epigeneticmodulation[J].NatureMethods,2016,13(2):127-137.Nature,2015,526(7571):55-61.[15]HILTONIB,D′IPPOLITOAM,VOCKLEYCM,etal.Epig‐[2]GARNEAUJE,DUPUISM-È,VILLIONM,etal.TheCRIS‐enomeeditingbyaCRISPR-Cas9-basedacetyltransferaseacti‐PR/Casbacterialimmunesystemcleavesbacteriophageandvatesgenesfrompromotersandenhancers[J].NatureBiotech‐plasmidDNA[J].Nature,2010,468(7320):67-71.nology,2015,33(5):510-517.[3]TERNSMP,TERNSRM.CRISPR-basedadaptiveimmune[16]KOMORAC,KIMYB,PACKERMS,etal.Programmablesystems[J].CurrentOpinioninMicrobiology,2011,14(3):editingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouble-strand‐321-327.edDNAcleavage[J].Nature,2016,533(7603):420-424.[4]AMITAIG,SOREKR.CRISPR-Casadaptation:Insightsinto[17]NISHIDAK,ARAZOET,YACHIEN,etal.Targetednucleo‐themechanismofaction[J].NatureReviewsMicrobiology,tideeditingusinghybridprokaryoticandvertebrateadaptive2016,14(2):67-76.immunesystems[J].Science,2016,353(6305):aaf8729.[5]CHARPENTIERE,RICHTERH,VANDEROOSTJ,etal.[18]DREISSIGS,SCHIMLS,SCHINDELEP,etal.Live-cellBiogenesispathwaysofRNAguidesinarchaealandbacterialCRISPRimaginginplantsrevealsdynamictelomeremove‐CRISPR-Casadaptiveimmunity[J].FEMSMicrobiologyRe‐ments[J].ThePlantJournal:forCellandMolecularBiology,views,2015,39(3):428-441.2017,91(4):565-573.[6]PLAGENSA,RICHTERH,CHARPENTIERE,etal.DNA[19]ROUETR,THUMABA,ROYMD,etal.Receptor-mediatedandRNAinterferencemechanismsbyCRISPR-Cassurveil‐deliveryofCRISPR-Cas9endonucleaseforcell-type-specificlancecomplexes[J].FEMSMicrobiologyReviews,2015,39(3):geneediting[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,442-463.2018,140(21):6596-6603.[7]NISHIMASUH,NUREKIO.Structuresandmechanismsof[20]ZHOUYX,WANGP,TIANF,etal.Paintingaspecificchro‐CRISPRRNA-guidedeffectornucleases[J].CurrentOpinionmosomewithCRISPR/Cas9forlive-cellimaging[J].CellRe‐inStructuralBiology,2017,43:68-78.search,2017,27(2):298-301.[8]MILLERJC,HOLMESMC,WANGJB,etal.Animproved[21]JIANGW,BIKARDD,COXD,etal.RNA-guidededitingofzinc-fingernucleasearchitectureforhighlyspecificgenomeed‐bacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems[J].NatureBio‐iting[J].NatureBiotechnology,2007,25(7):778-785.technology,2013,31(3):233-239.[9]CERMAKT,DOYLEEL,CHRISTIANM,etal.Efficientde‐[22]BAOZH,XIAOH,LIANGJ,etal.Homology-integratedsignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-CRISPR-Cas(HI-CRISPR)systemforone-stepmultigenedis‐basedconstructsforDNAtargeting[J].NucleicAcidsRe‐ruptioninSaccharomycescerevisiae[J].ACSSyntheticBiolo‐search,2011,39(12):e82.gy,2015,4(5):585-594.[10]SANTOS-MORENOJ,TASIUDIE,STELLINGJ,etal.Multi‐[23]XIEKB,YANGYN.RNA-guidedgenomeeditinginplantsstableanddynamicCRISPRi-basedsyntheticcircuits[J].Na‐usingaCRISPR-Cassystem[J].MolecularPlant,2013,6(6):tureCommunications,2020,11:2746.1975-1983.[11]LIUY,WANXY,WANGBJ.EngineeredCRISPRaenables[24]GUANLH,HANYW,ZHUSY,etal.ApplicationofCRIS‐programmableeukaryote-likegeneactivationinbacteria[J].PR-Cassystemingenetherapy:pre-clinicalprogressinanimalNatureCommunications,2019,10:3693.model[J].DNARepair,2016,46:1-8.

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