‘新番72号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨_张西英

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西北农业学报２０２３，３２（２）：２９０－２９８ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓＳｉｎｉｃａｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０２３．０２．０１３ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０２３．０２．０１３‘新番７２号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨张西英，刘江娜，李荣霞，薛丽萍，白云凤，张爱萍（新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠８３１３００）摘要为研究建立加工番茄‘新番７２号’的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因编辑系统。通过对番茄全基因组序列扫描，从ＳｌＡＣＳ２基因上游编码区筛选出高特异性ｓｇＲＮＡ，利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统对ＳｌＡＣＳ２基因进行定点突变使其失活，使系统Ⅰ乙烯正常表达以保证植株正常生长，又适度抑制系统Ⅱ乙烯生成，迟滞果实过熟软化，提高耐贮运性能。结果表明：在第１外显子的ｓｇＲＮＡ中，位于外显子１３２～１５４ｎｔ的ｓｇＲＮＡ１－１４特异性最好，ＧＣ含量较高，靶向特异性综合得分也较高，可为优选ｓｇＲＮＡ。第２外显子没有合适的ｓｇＲＮＡ可选择。试验共完成３９４份植株的测序工作，从中筛选出无Ｔ－ＤＮＡ的突变株６个，根据测序结果明确了不同植株的突变类型，其中３５７个植株发生突变，突变率为９０．６％，纯合突变率为３６．８％。这一技术较杂交育种周期短，较诱变育种定向性好，较常规基因工程安全性高，将为番茄的遗传改良研究建立一个高效安全的技术体系。关键词番茄；耐贮性；遗传转化；基因编辑［１１］新疆是中国主要的加工番茄种植基地，其机在效率和可控性方面则远远优于诱变育种。械采收已达到７０％以上。由于番茄果实易过熟番茄基因组较小，已完成了全基因组精细序软化，致使耐压性能变差、抗病原菌能力降低，已列分析，为通过全基因组层面扫描、筛选出高特异［１］严重影响到生产、贮运及加工品质。培育抗软性ｓｇＲＮＡ以规避脱靶效应提供了可靠的基因组化、耐贮运的番茄新品种对新疆加工番茄的种植序列和遗传背景，且遗传转化体系也已成熟。迄及加工产业的发展具有重要意义。今利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统改良番茄农艺性状的利用常规育种方法改良番茄品种周期长，易报道较少。番茄是二倍体自花授粉作物，利用［２］受不良基因连锁和种间生殖隔离的限制。近年ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统原位定点修饰乙烯代谢相关来，以多种新型高效的ＤＮＡ靶向内切酶为基础基因以迟滞番茄过熟腐烂，并通过自交分离剔除建立的基因组编辑技术（Ｖｏｙｔａｓ，２０１３），可以在不外源ＤＮＡ序列，获得无转基因序列的耐贮运新同物种中对目标基因进行定点敲除、单核苷酸或种质，为加工番茄新品种培育和功能基因研究提多核苷酸片段置换、添加等靶向修饰，不必通过导供技术支撑，也将为利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统改良［３－６］入反义基因或ＲＮＡｉ基因抑制靶基因功能。番茄其他农艺性状做出有益探索。在各种基因编辑技术中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术操［７－１０］１材料与方法作较为简单、高效，应用更为广泛，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统对目标基因进行精确的原位编辑后，不１．１材料必再通过转基因调控目标基因功能，而由于番茄品种为‘新番７２号’，由新疆生产建设兵ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９基因的整合位点和编辑位点是分离团第六师农科所番茄课题组选育提供。母本‘Ａ－的，因此可通过自交分离剔除ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９基１０’是从‘里格尔８７－５’中筛选出综合抗性好的株因，获得无转基因序列的新种质，比常规转基因技系，经过８代自交提纯得到的稳定材料，属早熟加术安全可靠。基因编辑修饰的基因只有少数核苷工番茄品种；父本‘ＭＧ－０１’是从国外引进的加工酸改变，与自然突变或人工理化诱变本质相同，而番茄材料‘ＪＱ－２３’，经７代分离、纯化得到的稳定、收稿日期：２０２１－０５－２４修回日期：２０２２－０２－２５基金项目：国家自然科学基金（３１７６０５７１）；新疆兵团强青科技创新人才计划（２０２１ＣＢ０３７）。第一作者：张西英，女，副研究员，研究方向为作物遗传育种。Ｅ－ｍａｉｌ：５９２３５４９６３＠ｑｑ．ｃｏｍ通信作者：刘江娜，女，副研究员，研究方向为作物遗传育种。Ｅ－ｍａｉｌ：２８４９８４７３７＠ｑｑ．ｃｏｍ张爱萍，女，研究员，研究方向为植物分子育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：３７９４０９４１９＠ｑｑ．ｃｏｍ

1２期张西英等：‘新番７２号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨·２９１·早熟品系，以番茄的下胚轴和子叶为外植体，农杆置，规避设计的ｓｇＲＮＡ被内含子相隔而成为无菌介导转化。效ｓｇＲＮＡ。根据ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９靶点设计原则，１．２方法利用ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ筛选ＳｌＡＣＳ２第１、２外显子番茄为呼吸跃变型果实，伴随呼吸跃变产生区域的ｓｇＲＮＡ序列，ｓｇＲＮＡ的结构设定为５′－大量乙烯，即系统Ⅱ乙烯，易使番茄果实过熟，腐（Ｎ）２０ＮＧＧ－３′，Ｎ为任意核苷酸。利用ＣＲＩＳＰＲ－烂变质。１－氨基环丙烷１－羧酸ＡＣＣ（１－ａｍｉｎｏｃｙ－Ｐ验证ｓｇＲＮＡ的靶向特异性，筛选出靶向特异性ｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）是合成乙烯的直接好的ｓｇＲＮＡ。前体，ＡＣＣ合酶ＡＣＳ（ＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅ）是乙烯合成１．２．２突变株的获得和突变类型的研究以番的限速酶，由多基因家族编码，ＳｌＡＣＳ１和茄的下胚轴和子叶为外植体，农杆菌介导转化，抗ＳｌＡＣＳ６等主导系统Ｉ乙烯的合成，ＳｌＡＣＳ２和性筛选和分子检测获得Ｔ０代转基因阳性植株，ＳｌＡＣＳ４主导系统Ⅱ乙烯的合成。利用多种信息然后筛选获得Ｔ０代突变植株自交结实后得到的学工具从ＳｌＡＣＳ２基因上游的编码区筛选出高特Ｔ１代种子，将Ｔ１代种子播种成苗后提取叶片基异性ｓｇＲＮＡ，通过ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因组编辑系因组ＤＮＡ特异性引物检测，确定突变类型，并筛统仅对ＳｌＡＣＳ２基因进行定点突变，调控系统Ⅱ选纯合突变植株。乙烯过量表达，而不影响ＳｌＡＣＳ家族其他基因序２结果与分析列，以保证番茄正常生长发育，又适度抑制系统Ⅱ乙烯的生成，以期迟滞番茄过熟腐烂。２．１基于ＲＮＡ－ｓｅｑ的ＳｌＡＣＳ２数字表达谱１．２．１ＳｌＡＣＳ２ｓｇＲＮＡ的设计和选择克隆待以番茄功能基因组数据库网站（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｄ．改良加工番茄品种‘新番７２号’等的ＳｌＡＣＳ２基Ｂｔｉ．ｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／）中ＲＮＡ－ｓｅｑｄａｔａ的数因ｃＤＮＡ，以此作ｑｕｅｒｙ进行ＢＬＡＳＴ，确定据作基础，建立ＳｌＡＣＳ２基因的基于ＲＮＡ－ｓｅｑ的ＳｌＡＣＳ２的基因组结构以及外显子所在染色体位数字表达谱（图１）。１．子房；２．半绿果实；３．成熟绿果实；４．破色期果实；５．成熟红果实；６．０～３ｍｍ花蕾；７．３～８ｍｍ花蕾；８．８ｍｍ开花前花蕾；９．完全展开花；１０．发育阶段花的混合物；１１．野生番茄花粉；１２．感染假单胞菌叶片；１３．假单胞菌叶片；１４．混合诱导叶片；１５．４～６周龄植株的顶端分生组织；１６．８周龄植株顶端分生组织；１７．花前根；１８．挂果期根；１９．营养匮乏的根；２０．完全吸涨５ｄ后的胚根；２１．完全吸涨７ｄ后的幼苗；２２．休眠种子；２３．愈伤组织；ＰＲＫＭ．每百万ｒｅａｄｓ中来自于特定基因每千碱基长度的ｒｅａｄｓ数１．Ｏｖａｒｙ；２．Ｇｒｅｅｎｆｒｕｉｔ；３．Ｒｉｐｅｇｒｅｅｎｆｒｕｉｔ；４．Ｆｒｕｉｔａｔｂｒｏｋｅｎｃｏｌｏｒｓｔａｇｅ；５．Ｒｉｐｅｒｅｄｆｒｕｉｔ；６．０ｔｏ３ｍｍｉｎｂｕｄ；７．３－８ｍｍｉｎｂｕｄ；８．８ｍｍｂｅｆｏｒｅｆｌｏｗｅｒｉｎｇｂｕｄｓ；９．Ｆｕｌｌｙｅｘｐａｎｄｅｄｆｌｏｗｅｒ；１０．Ａｍｉｘｔｕｒｅｏｆｆｌｏｗｅｒｓａｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅ；１１．Ｗｉｌｄｔｏｍａｔｏｐｏｌｌｅｎ；１２．ＬｅａｖｅｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；１３．ＬｅａｖｅｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；１４．Ｍｉｘｅｄｉｎｄｕｃｅｄｂｌａｄｅ；１５．Ａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍｏｆｐｌａｎｔｓ４－６ｗｅｅｋｓｏｌｄ；１６．Ａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍａｔａｇｅｏｆ８ｗｅｅｋｓ；１７．Ｒｏｏｔｂｅｆｏｒｅｆｌｏｗｅｒｉｎｇ；１８．Ｒｏｏｔａｔｆｒｕｉｔｓｔａｇｅ；１９．Ｒｏｏｔｓｗｉｔｈｄｅｆｉｃｉｅｎｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎ；２０．Ｔｈｅｃｏｍ－ｐｌｅｔｅｌｙａｂｓｏｒｂｅｄｒａｄｉｃｌｅａｆｔｅｒ５ｄａｙｓ；２１．Ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｓｕｃｋｅｄｕｐａｆｔｅｒ７ｄａｙｓ；２２．Ｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ；２３．Ｃａｌｌｕｓ；ＰＲＫＭ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｒｅａｄｓｆｏｒｏｎｅｋｉｌｏｂａｓｅｌｅｎｇｔｈｆｒｏｍａｐａｒｔｉｃｕｌａｒｇｅｎｅｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｒｅａｄｓ图１基于ＲＮＡ－ｓｅｑ的ＳｌＡＣＳ２数字表达谱Ｆｉｇ．１ＤｉｇｉｔａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＳｌＡＣＳ２ｂａｓｅｄｏｎＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ

2·２９２·西北农业学报３２卷结果显示：ＳｌＡＣＳ２在番茄的子房、愈伤组织扩增后对目的基因进行回收与纯化。先对中有低水平表达，在破色期果实、成熟的红果实中ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下含有较高水平的表达。证实了ＳｌＡＣＳ２是与果实成有目的片段的凝胶，用ＤＮＡ凝胶回收盒回收测熟相关的基因，利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术对该基因序。利用ＤＮＡｍａｎ进行序列比对，克隆基因与进行原位编辑，可能会减缓番茄内源乙烯的产生，ＮＭ＿００１２４７２４９．２完全一致，见图２。同时，新疆迟滞番茄过熟，提高储运品质。番茄ａｃｓ２基因的ｃｄｓ及编辑位点见图３。２．２同源克隆新疆番茄ＡＣＳ２基因２．３ＳｌＡＣＳ２染色体定位和基因组结构以ｃＤＮＡ为模板，在ＮＣＢＩ上对序列进行查以ＳｌＡＣＳ２的ｃｄｓ作ｑｕｅｒｙ，对ＮＣＢＩ番茄基找和分析，设计引物，如表１所示，进行ＡＣＳ２基因组数据库进行Ｂｌａｓｔ，结果表明，由图４可知，因序列的扩增。ＳｌＡＣＳｇＤＮＡ位于番茄的１号染色体（Ｇｅｎ－表１目的基因扩增引物ＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＣ＿０１５４３８．２），位置在Ｔａｂｌｅ１Ｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ８８４５６０１１～８８４５３４９０ｎｔ之间，长度２５２２ｎｔ，引物Ｐｒｉｍｅｒ序列（５′→３′）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ由４个外显子、３个内含子组成，前３个外显子较上游引物ＵｐｓｔｒｅａｍＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＧＡＣ短，位于ＳｌＡＣＳ２的５′端，可在每个外显子区域设ｐｒｉｍｅｒ计ｓｇＲＮＡ，规避ｓｇＲＮＡ分布在外显子和内含子下游引物ＤｏｗｎｓｔｒｅａｍＴＴＡＡＣＧＡＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡ连接处。ｐｒｉｍｅｒｓ图２ＤＮＡｍａｎ序列比对结果Ｆｉｇ．２ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆＤＮＡｍａｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ２．４ｓｇＲＮＡ的设计和选择列，易产生脱靶效应。在剩余７条ｓｇＲＮＡ中，位根据ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９靶点设计原则，利用于外显子１３２～１５４ｎｔ的ｓｇＲＮＡ１－１４特异性最ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）筛选好，该ｓｇＲＮＡ和它包含的对特异性起重要作用ＳｌＡＣＳ２外显子区域的ｓｇＲＮＡ序列，即３′端有的、邻近ＰＡＭ的１２ｎｔ种子序列在番茄基因组上ＰＡＭ元件的２０个连续的碱基序列，ＰＡＭ元件都是唯一序列，没有与之完全匹配的序列。设定为ＮＧＧ，ｓｇＲＮＡ的结构为５′－（Ｎ）２０ＮＧＧ－ｓｇＲＮＡ１－１４的ＧＣ含量较高，靶向特异性综合得３′，Ｎ为任意核苷酸。利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／分也较高，可为优选ｓｇＲＮＡ。由表３可见，第２ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／）对ｓｇＲＮＡ的靶向特异外显子有９条ｓｇＲＮＡ序列，其ＧＣ含量均低于性进行综合评分，由表２、３可知，综合得分在３５％，临近ＰＡＭ１２ｎｔ的种子序列的脱靶位点在２２９～４９。个以上，没有合适的ｓｇＲＮＡ可以选择。根据ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ在线分析，由表２可见，２．５番茄遗传转化体系的建立在第１外显子的ｓｇＲＮＡ中，有９条含有连续的对加工番茄‘新番７２号’的种子消毒处理后ＴＴＴＴ序列，可排除。ｓｇＲＮＡ１－２的ＧＣ含量低，置于１／２培养基上发芽，获得无菌苗。通过苗龄、ｓｇＲＮＡ１－７在５号染色体上也有完全匹配的序外植体对番茄愈伤组织及不定芽诱导的影响和不

3２期张西英等：‘新番７２号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨·２９３·图３新疆番茄ａｃｓ２基因的ｃｄｓ及编辑位点Ｆｉｇ．３ｃｄｓａｎｄｅｄｉｔｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆａｃｓ２ｇｅｎｅｉｎＸｉｎｊｉａｎｇ’ｓｔｏｍａｔｏ图４ＳｌＡＣＳ２染色体定位和基因组结构Ｆｉｇ．４ＳｌＡＣＳ２ｌｏｃａｔｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅ同激素浓度配比对愈伤组织和芽分化诱导的影夜的最佳转化条件（图６）。响，最终筛选建立了无菌苗快繁再生体系（图５）。将与农杆菌共侵染后的愈伤组织分别放入含通过对农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间等有Ｋａｎ的筛选培养基中进行初步筛选培养，在筛方面对番茄遗传转化率的影响进行研究，筛选出选过程中，首先用２０ｍｇ／ＬＫａｎ的筛选培养基上适宜的转化条件。最终通过多次筛选试验，确定培养１５ｄ后，转接至４０ｍｇ／ＬＫａｎ筛选培养基上了农杆菌ＯＤ６００为０．６～０．８为宜，以０．７最佳，培养２０ｄ，最终在６０ｍｇ／ＬＫａｎ筛选培养基上培预培养２ｄ，侵染时间为１５ｍｉｎ，侵染后暗培养一养，这样即能保证转化的愈伤组织正常分化，分化

4·２９４·西北农业学报３２卷出的抗性不定芽生长正常，也可减少逃逸芽的产生（图７）。表２ＳＩＡＣＳ２基因第１外显子含有的ｓｇＲＮＡｓＴａｂｌｅ２ｓｇＲＮＡｓｏｆｅｘｏｎ１ｉｎＳＩＡＣＳ２ｇｅｎｅ位置序列信息目标数量Ｐｏｓｉｔｉｏｎ目标序列ＳｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒｏｆｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓ编号分值ＴａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅＮｏ．Ｓｏｒｅ起点－终点＋２０ｍｅｒ＋ＰＡＭ（ｔｏｔａｌ２３ｍｅｒ）ＴＴＴＴｉｎ２０ｍｅｒ＋１２ｍｅｒ＋ＧＣ／％Ｔｍ／℃Ｓｔａｒｔ－Ｅｎｄ－２０ｍｅｒＰＡＭＰＡＭ１－１２３～４５－ＣＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＧ２５．００５７．１４＋１１４３６１－２２４～４６＋ＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＧＧ２５．００５７．１４－１２７３７１－３４３～６５＋ＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧ４０．００６８．９１－１６４８１－４６７～８９＋ＧＡＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧ３５．００６３．５９＋１３３５１－５６８～９０＋ＡＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＧ３０．００６２．４４＋１１３３１１－６７１～９３＋ＡＣＴＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧ４５．００７０．１１＋１１１３２１－７７６～９８－ＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣ４０．００６７．７５－２５２９１－８１１２～１３４－ＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＣ４５．００７０．９２＋１２４５１－９１１７～１３９－ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧ５０．００７１．９６＋１６４７１－１０１１８～１４０＋ＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧ４５．００７０．８７－１５４６１－１１１２０～１４２－ＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧＡＧ４５．００６９．９３＋１１０４８１－１２１２１～１４３－ＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴ４５．００７０．４４＋１３４８１－１３１３２～１５４＋ＣＣＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧ５０．００７２．８５－１４４９１－１４１３２～１５４－ＣＣＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧ４５．００６８．０６－１１４９１－１５１３３～１５５＋ＣＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧＧ４５．００７０．１２－１５４９１－１６１３３～１５５－ＣＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧＧ４５．００７０．１２－１２４９１－１７１３４～１５６－ＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧＧＴ４５．００７１．７０－１２４８１－１８１４７～１６９－ＣＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣ４０．００６７．２４＋１３４５表３ＳＩＡＣＳ２基因第２外显子含有的ｓｇＲＮＡｓＴａｂｌｅ３ｓｇＲＮＡｓｏｆｅｘｏｎ２ｉｎＳＩＡＣＳ２ｇｅｎｅ位置序列信息目标数量Ｐｏｓｉｔｉｏｎ目标序列ＳｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒｏｆｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓ编号分值ＴａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅＮｏ．Ｓｏｒｅ起点－终点＋２０ｍｅｒ＋ＰＡＭ（ｔｏｔａｌ２３ｍｅｒ）ＴＴＴＴｉｎ２０ｍｅｒ＋１２ｍｅｒ＋ＧＣ／％Ｔｍ／℃Ｓｔａｒｔ－Ｅｎｄ－２０ｍｅｒＰＡＭＰＡＭ２－１５～２７＋ＧＴＴＴＡＧＡＣＴＴＧＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧ３０．００６０．８１－１８４６２－２２５～４７＋ＴＧＧＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧ３５．００６５．５８－１３４３２－３３９～６１－ＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧ３０．００６０．４４＋１１８４１２－４４０～６２－ＣＣＡＡＡＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＡ３０．００６１．９１－１１３４２２－５４３～６５＋ＡＡＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧ３０．００６１．９１－１１０３８２－６６０～８２＋ＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧ３０．００６１．４６－１１４３９２－７８３～１０５－ＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴ３０．００６２．７３－１４４３２－８８８～１１０＋ＧＣＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧ３５．００６４．０９－２２０３０２－９８９～１１１－ＣＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＣ３５．００６４．３４－１２９４６２．６Ｃａｓ９转基因番茄再生植株的ＰＣＲ检测及编辑植株分子鉴定以质粒ｐＳｌＡＣＳ２－ＤｓｇＲＮＡ为阳性对照，以野生型加工番茄‘新番７２号’为阴性对照，利用ＣＴＡＢ法提取Ｔ０代植株的ＤＮＡ，通过表４中的筛选引物，对获得的２１个抗性再生植株以Ｃａｓ９特异引物进行ＰＣＲ扩增检测是否将ＣＡＳ９系统成功转入，其中７株扩增出了大小为８４１ｂｐ的目的条带，与阳性对照一致，未转化的野生植株未扩增出目的条带，见图８，初步表明基因已经整合到图５番茄无菌苗转化受体基因组中。ＰＣＲ扩增体系为：基因组Ｆｉｇ．５Ａｓｅｐｔｉｃｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆｔｏｍａｔｏ

5２期张西英等：‘新番７２号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨·２９５·ＤＮＡ１μＬ，ＰｒｅｍｉｘＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｍｉｘ５８℃３０ｓ；７２℃３０ｓ；３５个循环；７２℃５ｍｉｎ，１０μＬ，前后引物各０．８μＬ，加双蒸水至２０μＬ；ＰＣＲ产物的大小通过１．０％的琼脂糖凝胶电泳ＰＣＲ扩增条件分别为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ；得到。图６番茄遗传转化再生植株Ｆｉｇ．６Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ图７抗性筛选Ｆｉｇ．７Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ表４筛选ＰＣＲ引物特异引物进行ＰＣＲ扩增、测序及比对分析，确定Ｔａｂｌｅ４ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ编辑突变体的突变类型，并筛选纯合突变单株。ｃａｓ９－ｕ６测序引物目前试验共完成３９４份植株的测序工作，从中筛序列（５′→３′）ｃａｓ９－ｕ６ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｅｑｕｅｎｃｅ选出无Ｔ－ＤＮＡ的突变株６个，根据测序结果明ｐｒｉｍｅｒ上游引物确了不同植株的突变类型，对测序结果进行归纳ＴｈｅｕｐｓｔｒｅａｍＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣｐｒｉｍｅｒ总结，其中３５７个植株发生突变，突变率为下游引物９０．６％，纯合突变率为３６．８％。ＤｏｗｎｓｔｒｅａｍＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＣＣＧｐｒｉｍｅｒ通过调查得到种子萌发率、苗期生长情况及２．７ＳｌＡＣＳ２基因编辑植株的初步分子鉴定采摘期果实发育情况等相关指标，初步明确不同将收获的Ｔ０代突变株自交结实的Ｔ１代种突变类型会对加工番茄生长和果实发育产生影子播种于大田中，提取温室内Ｔ１代植株ＤＮＡ，利响，同一突变类型表现型也不尽相同。由图９可用表５中的特异引物进行ＰＣＲ扩增，使用靶位点见，以ＳｇＲＮＡ２处缺失７个碱基的突变类型为

6·２９６·西北农业学报３２卷例，在统计过程中发现，株型多数发育不正常，表现为株型小叶片卷曲，果实发育也不正常，果型小多为裂果，但也有少数植株生长发育正常，果型正常结果多、成熟好。３讨论与结论果实过熟导致软化腐烂是影响新疆加工番茄种植贮运及加工品质的重要限制因素。而常规杂交育种改良周期长，可利用的种质资源有限；理化诱变难以控制突变方向，突变位点鉴定困难；常规Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；＋．阳性质粒；ＷＴ（－）．阴性对基因工程易使民众产生安全性疑虑等诸多限制因照；１～４．转基因抗性植株［１２－１４］素。通过ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９这一新型基因组定Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；＋．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｓｍｉｄ；ＣＫ．Ｎｏｎ－点编辑系统用于番茄耐贮性能改良，通过对ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；１－４．Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓ图８部分转化植株基因组ＤＮＡＰＣＲ检测ＳｌＡＣＳ２基因特定位点进行精准修饰，同时不影Ｆｉｇ．８ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｅＤＮＡｉｎ响ＳｌＡＣＳ基因其他家族基因序列，迟滞果实过熟ｐａｒｔｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ软化，提高耐贮运性能，从根本上解决加工番茄贮表５筛选ＰＣＲ引物藏时间短、不耐运输、严重影响加工品质等诸多问Ｔａｂｌｅ５ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ题；利用Ｃａｓ９基因整合位点和编辑位点相互独编辑检测引物序列（５′→３′）立的特点，通过遗传分离，剔出Ｔ－ＤＮＡ序列，获ＥｄｉｔｉｏｎｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ得无转基因组分的耐贮运新种质。这一技术较杂上游引物交育种周期短，较诱变育种定向性好，较常规基因ＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＡＡＣＵｐｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ下游引物工程安全性高，将为加工番茄的遗传改良建立一ＣＣＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＤｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ个高效安全的技术体系。图９ＳｇＲＮＡ２处缺失７个碱基Ｆｉｇ．９ＳｅｖｅｎｂａｓｅｓｍｉｓｓｅｄａｔＳｇＲＮＡ２番茄是植物学研究的经典模式系统之一，已ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ，２０１９，３５（６）：９－１５．［２］张尧，李忠晴，张丽，等．天山雪莲ｓｉｋＰ基因提高番茄经完成了全基因组精细序列分析，通过突变体揭类黄酮含量的研究［Ｊ］．西南农业学报，２０１８，３１（６）：１１４３－［１５－１８］示基因功能成为重要研究内容。建立加工番１１４７．茄有效的基因敲除技术体系，可促进其基因功能ＺＨＡＮＧＹ，ＬＩＺＨＱ，ＺＨＡＮＧＬ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｓａｕｓ－的研究发展，完善加工番茄ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因编ｓｕｒｅａｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａＭＹｂｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｋＰｇｅｎｅｓｔｏ辑系统将为加工番茄基因功能研究、改良其他农ｉｍｐｒｏｖｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ［Ｊ］．ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａＪｏｕｒ－ｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１８，３１（６）：１１４３－１１４７．艺性状、培育新品种提供新的平台和技术支撑，具［３］姚祝平，程远，万红建．等．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术有较大的应用前景。在植物基因工程育种中的应用［Ｊ］．分子植物育种，２０１７，１５（７）：２６４７－２６５５．参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＹＡＯＺＨＰ，ＣＨＥＮＧＹ，ＷＡＮＨＪ，ｅｔａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ［１］张圆圆，邵冬南，崔百明．基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９加工番茄ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｐｌａｎｔｇｅｎｅｔｉｃα－Ｍａｎ突变体的构建［Ｊ］．生物技术通报，２０１９，３５（６）：９－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０１７，１５．１５（７）：２６４７－２６５５．ＺＨＡＮＧＹＹ，ＳＨＡＯＤＮ，ＣＵＩＢＭ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏ－［４］包爱科，白天惠，赵天璇，等．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统：基因组定ｃｅｓｓｉｎｇｔｏｍａｔｏα－ｍａｎｍｕｔａｎｔｂａｓｅｄｏｎＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９［Ｊ］．点编辑技术及其在植物基因功能研究中的应用［Ｊ］．草业学

7２期张西英等：‘新番７２号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨·２９７·报，２０１７，２（７）：１９０－２００．ｍａｔｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，ＢＡＯＡＫ，ＢＡＩＴＨ，ＺＨＡＯＴＸ，ｅｔａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ａ１０（２）：９６－１０２．ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆ［１１］李树磊，郑红艳，王磊．基因编辑技术在作物育种中的应ｐｌａｎｔｇｅｎｅｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，用与展望［Ｊ］．生物技术通报，２０２０，３６（１１）：２０９－２２１．２０１７，２６（７）：１９０－２００．ＬＩＳＨＬ，ＺＨＥＮＧＨＹ，ＷＡＮＧＬ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｓ－［５］单奇伟，高彩霞．植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展ｐｅｃｔｏｆｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｒｏｐｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏ－［Ｊ］．遗传，２０１５，３７（１０）：９５３－９７３．ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ，２０２０，３６（１１）：２０９－２２１．ＳＨＡＮＱＷ，ＧＡＯＣＸ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｇｅｎｏｍｅｅｄｉ－［１２］成妍，焦彦生，乔宁，等．应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９体系对番ｔｉｎｇａｎｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ，茄ＰＳＹ１基因的定点编辑［Ｊ］．中国蔬菜，２０１８（１１）：３２－３８．２０１５，３７（１０）：９５３－９７３．ＣＨＥＮＧＹ，ＪＩＡＯＹＳＨ，ＱＩＡＯＮ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｍｏｄｉｆｉ－［６］陈银华，李汉霞，叶志彪．不同结构的外源ＡＣＯ基因导入番ｃａｔｉｏｎＰＳＹ１ｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｔｏｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ茄对乙烯生成速率的影响［Ｊ］．园艺学报，２００７，３４（３）：６４４－［Ｊ］．ＣｈｉｎａＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ，２０１８（１１）：３２－３８．６４８．［１３］刘耀，熊莹喆，蔡镇泽，等．基因编辑技术的发展与挑战ＣＨＥＮＹＨ，ＬＩＨＸ，ＹＥＺＨＢ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ［Ｊ］．生物工程学报，２０１９，３５（８）：１４０１－１４１０．ｄｉｆｆｅｒｅｎｔＴ－ＤＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＡＣＯｇｅｎｅｔｏｔｏｍａｔｏｇｅｎｏｍｅＬＩＵＹ，ＸＩＯＮＧＹＪ，ＣＡＩＺＨＺ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｏｎｅｔｈｙｌｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅ［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｏｆｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ２００７，３４（３）：６４４－６４８．ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３５（８）：１４０１－１４１０．［７］郑红艳，王磊．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术及其在作物育［１４］蒲艳，刘超，李继洋等，番茄Ｕ６启动子的克隆及种中的应用［Ｊ］．生物技术进展，２０１８，８（３）：１８５－１９０．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑体系的建立［Ｊ］．中国农业科学，ＺＨＥＮＧＨＹ，ＷＡＮＧＬ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ２０１８，５１（２）：３１５－３２６．ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｒｏｐｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＢｉ－ＰＵＹ，ＬＩＵＣＨ，ＬＩＪＹ，ｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＳｌＵ６ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８，８（３）：１８５－１９０．ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅ［８］叶志彪，李汉霞，刘勋甲，等．利用转基因技术育成耐贮藏番ｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｔｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＳｉｎｉ－茄一华番１号［Ｊ］．中国蔬菜，１９９９（１）：６－１０．ｃａ，２０１８，５１（２）：３１５－３２６．ＹＥＺＨＢ，ＬＩＨＸ，ＬＩＵＸＪ，ｅｔａｌ．Ａｎｅｗｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏ［１５］ＢＲＯＯＫＳＣ，ＮＥＫＲＡＳＯＶＶ，ＬＩＰＰＭＡＮＺＢ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｉ－ｃｕｌｔｉｖａｒ－ＢｉｏｓｃｉｅｎｂｒｅｄｗｉｔｈａｎｔｉｓｅｎｓｅＥＦＥｃＤＮＡ［Ｊ］．ＣｈｉｎａｃｉｅｎｔｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｔｏｍａｔｏｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ，１９９９（１）：６－１０．ｔｈｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅ－［９］叶志彪，李汉霞．两个反义基因在番茄工程植株中的生理抑ｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ９ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏ－制效应分析［Ｊ］．植物生理学报，１９９６，２２（２）：１５７－１６０．ｇｙ，２０１４，１６６：１２９２－１２９７．ＹＥＺＨＢ，ＬＩＨＸ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｗｏａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｎ－［１６］ＬＩＵＬ，ＦＡＮＸＤ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍ：ａｐｏｗｅｒｆｕｌｔｏｏｌｈｉｂｉｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｔｏｍａｔｏｅｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９６，２２（２）：２０１４，８５（３）：２０９－２１８．１５７－１６０．［１７］ＪＡＣＯＢＳＴＢ，ＬＡＦＡＹＥＴＴＥＰＲ，ＳＣＨＭＩＴＺＲＪ，ｅｔａｌ．［１０］鞠戎，田颖川，沈全光，等．番茄多聚半乳糖醛酸酶ｃＤ－ＴａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｓｏｙｂｅａｎｗｉｔｈＣＲＩＳＰＲ／ＮＡ的克隆及其对番茄中ＰＧ表达的反义抑制［Ｊ］．生物工Ｃａｓ９［Ｊ］．ＢｉｏｌｏｇｙＭｅｄＣｅｎｔｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，程学报，１９９４，１０（２）：９６－１０２．１５（１）：１６．ＪＵＲ，ＴＩＡＮＹＣＨ，ＳＨＥＮＱＧ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆｐｏｌｙｇａ－［１８］ＭＡＬＩＰ，ＹＡＮＧＬ，ＥＳＶＥＬＴＫＭ，ｅｔａｌ．ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｈｕ－ｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ（ＰＧ）ｃＤＮＡａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｔｓａｎｔｉ－ｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖｉａＣａｓ９［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，ｓｅｎｓｅＲＮＡｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＧｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏ－３３９（６１２１）：８２３－８２６．

8·２９８·西北农业学报３２卷ＳｔｕｄｙｏｎＳｔｏｒａｇｅＴｏｌｅｒａｎｃｅｏｆＳｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｔｉｏｎｏｆ‘Ｘｉｎｆａｎ７２’ＰｒｏｃｅｓｓｅｄＴｏｍａｔｏＺＨＡＮＧＸｉｙｉｎｇ，ＬＩＵＪｉａｎｇｎａ，ＬＩＲｏｎｇｘｉａ，ＸＵＥＬｉｐｉｎｇ，ＢＡＩＹｕｎｆｅｎｇａｎｄＺＨＡＮＧＡｉｐｉｎｇ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＳｉｘｔｈＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＣｏｒｐｓ，ＷｕｊｉａｑｕＸｉｎｊｉａｎｇ８３１３００，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｃｒｉｓＰＲ－Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒ‘Ｘｉｎｆａｎ７２’ｔｏｍａｔｏ，ｓｇＲＮＡｗｉｔｈｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｆｒｏｍｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＳｌＡＣＳ２ｇｅｎｅｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｏｍａｔｏ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＳｌＡＣＳ２ｇｅｎｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎａｃｔｉｖａｔｅＳｌＡＣＳ２ｇｅｎｅｂｙｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ．ＥｔｈｙｌｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｓｙｓｔｅｍⅠｗａｓｎｏｒｍａｌｌｙｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄｔｏｅｎｓｕｒｅｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｐｌａｎｔ，ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｓｙｓｔｅｍⅡｗａｓｍｏｄｅｒ－ａｔｅｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄ，ｗｈｉｃｈｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｄｅｌａｙｏｆｆｒｕｉｔｏｖｅｒ－ｒｉｐｅｎｉｎｇａｎｄｓｏｆｔｅｎｉｎｇ，ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｓｔｏｒａｇｅａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｇＲＮＡ１－１４ｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｅｘｏｎ１３２－１５４ｎｔｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｈｉｇｈｅｒＧＣｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｈｉｇｈｅｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｓｃｏｒｅｏｆｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｐｅｃｉ－ｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｓｇＲＮＡ．Ｅｘｏｎ２ｄｉｄｎｏｔｈａｖｅｓｕｉｔａｂｌｅｓｇＲＮＡｔｏｃｈｏｏｓｅ．Ａｔｏｔａｌｏｆ３９４ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄ６ｔ－ＤＮＡ－ｆｒｅｅｍｕｔａｎｔｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ，ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｔｙｐｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ３５７ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｍｕｔａ－ｔｅｄ，ｗｉｔｈｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ９０．６％ａｎｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ３６．８％．Ｔｈｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｈａｓｓｈｏｒ－ｔｅｒｃｙｃｌｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｙｂｒｉｄｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｉｔｓｄｉｒｅｃｔｉｖｉｔｙｉｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｔｈｅｓａｆｅｔｙｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｗｉｌｌｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｓａｆｅｔｅｃｈ－ｎｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｔｏｍａｔｏ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＴｏｍａｔｏ；Ｓｔｏｒａｇｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ；Ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＧｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇＲｅｃｅｉｖｅｄ２０２１－０５－２４Ｒｅｔｕｒｎｅｄ２０２２－０２－２５ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．３１７６０５７１）；ＥｘｃｅｌｌｅｎｔＹｏｕｎｇＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＴａｌｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＣｏｒｐｓ（Ｎｏ．２０２１ＣＢ０３７）．ＦｉｒｓｔａｕｔｈｏｒＺＨＡＮＧＸｉｙｉｎｇ，ｆｅｍａｌｅ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｒｅｓｅａｒｃｈｆｅｌｌｏｗ．Ｒｅｓｅａｒｃｈａｒｅａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｌａｎｔｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：５９２３５４９６３＠ｑｑ．ｃｏｍＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒＬＩＵＪｉａｎｇｎａ，ｆｅｍａｌｅ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｒｅｓｅａｒｃｈｆｅｌｌｏｗ．Ｒｅｓｅａｒｃｈａｒｅａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｌａｎｔｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：２８４９８４７３７＠ｑｑ．ｃｏｍＺＨＡＮＧＡｉｐｉｎｇ，ｆｅｍａｌｅ，ｒｅｓｅａｒｃｈｆｅｌｌｏｗ．Ｒｅｓｅａｒｃｈａｒｅａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｌａｎｔｂｒｅｅｄｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅ－ｍａｉｌ：３７９４０９４１９＠ｑｑ．ｃｏｍ（责任编辑：潘学燕Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｅｄｉｔｏｒ：ＰＡＮＸｕｅｙａｎ）