生化实验汇总

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生物化学基础实验教学课件中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室生化与分子生物学实验室于乐军

1目录实验一生物化学实验技能培训实验二蛋白质部分性质实验实验三Folin-wu法定量测定血糖的含量实验四Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度实验五氨基酸的纸层析实验六醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白实验七胰蛋白酶的活力测定实验八酵母RNA的提取及鉴定实验九DNA的定量测定实验十水果中维生素C的定量测定实验十一聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

2生物化学实验技能培训中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

3通过生物化学实验应该做到：⑴学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。⑵训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。⑶学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。⑷掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

4实验室规则⑴实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理。⑵实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。⑶实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

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6⑹配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。⑺强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。⑻使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

7⑼实验室内严禁吸烟、饮水和进食，严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。⑽实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。⑾严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。⒀每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

8蛋白质部分性质实验—蛋白质颜色反应和沉淀反应中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

9蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。第一部分蛋白质的颜色反应中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室一、试验原理

10二、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、pH试纸6、水浴锅三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4、1%CuSO4：1gCuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml5、10%NaOH：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml6、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.7、尿素晶体8、浓硝酸9、冰醋酸10、浓硫酸中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

11（一）米伦（Millon’s）反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。操作：1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon’s试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millon’s试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室四、实验步骤

12（二）双缩脲反应原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。操作：1、尿素实验取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。2、蛋白液实验取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

13（三）黄色反应原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

14（四）茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

15第二部分蛋白质的沉淀反应一、试验原理蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

16二、实验仪器1、移液管2、吸管3、试管4、电炉三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml6、硫酸铜溶液：1gCuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml7、氯化钠晶体8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。10、1%醋酸溶液。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

17四、实验步骤（一）蛋白质的盐析作用原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

18（二）有机溶剂沉淀蛋白质原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。操作：取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

19（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

20（四）生物碱试剂沉淀蛋白质原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。操作：取2支试管，分别加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

21（一）  米伦（Millon’s）反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millon’s试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。（二）  双缩脲反应1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察现象。2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察现象。（三）  黄色反应取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？（四）  茚三酮反应取蛋白液1ml于试管中，加10滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。（一）蛋白质的盐析作用1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少，随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。蛋白质的颜色反应蛋白质的沉淀中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

22注意事项：1.吸取蛋白液的移液管必须专管专用，否则容易污染其他试剂。2.米伦试剂含有腐蚀性物质，一定小心使用。3.电炉加热试管时，试管口严禁朝向人。

23http://222.195.234.199/openclass登录名：自己的学号密码：自己的学号大家先把电子版的实验报告作好，然后在周五或周六以后再上传文件实验报告要求：1目的2原理3实验仪器4实验试剂5实验步骤6实验结果7实验分析下次实验：血糖的定量测定-folin-wu法中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

24Folin-Wu法定量测定血糖的含量中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

251.氧化供能2.人体的主要组成成分之一糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代谢紊乱→供能障碍→一系列代谢变化糖的重要生理功能：中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

26血糖及血糖水平的概念：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：3.9∽6.7mmol/L中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

27血糖的来源和去路中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

28血糖测定的目的和意义临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖水平异常：⑴高血糖及糖尿病；⑵低血糖中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

29高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

30症状＋随机血浆葡萄糖≥11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦糖尿病的诊断标准中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

31血糖的测定方法测定方法酶法：（1）己糖激酶法（HK）（2）葡萄糖氧化酶法（GOD法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵无机化学法：Folin-Wu法，特异性差有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

32掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。学会制备无蛋白血滤液。掌握7200型可见分光光度计的使用方法。一、目的要求中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

33二、实验原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。Cu2+(CuSO4)+葡萄糖Cu+（Cu2O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物—钼蓝。Cu2O+酸性钼酸试剂蓝色钼化合物OD420比色血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

34三、实验仪器1、25mL血糖管×3支；2、血糖管橡胶塞×3个；3、沸水浴小锅×1个；4、100mL锥形瓶×2个；5、电炉×1个；6、滤纸×1盒；7、吸耳球×2个；8、7200型分光光度计×1台;血糖管7200型分光光度计中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

351、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。四、实验试剂中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

365、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。四、实验试剂中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

371、无蛋白血滤液的制备：用5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/LH2SO41-2滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。五、实验步骤中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

382、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

39按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0×C0÷0.1×100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数;C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=样品液光吸收值;A0=标准液光吸收值0.1：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血六、结果计算：中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

40注意事项：1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10％硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。　如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

41【思考题】1、实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？2、实验中，血糖管有什么作用？3、实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

42五、实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水7ml摇匀10%钨酸钠1ml摇匀0.33mol/LH2SO41ml边加边摇,加毕充分摇匀放置5—15分(沉淀变为暗棕色)(如不变色,再加0.33mol/LH2SO41~2滴)干滤纸过滤无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血)20ml锥形瓶溶血(变为红色透明)用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：m=OD1/OD2×C×10×100中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

43分光光度计的工作原理中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

44朗伯-比尔定律朗伯定律：A=k1L比尔定律：A=k2C朗伯-比尔定律：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。A=KLC中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

45朗伯-比尔定律应用A标=KC标LA样=KC样L标准品法测定未知样品含量C样=A样A标×C标中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

467200型分光光度计的操作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热20分钟。用键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

47将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0”中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

48按MODE键选择A模式将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

49中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

50中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

51分光光度计的使用注意事项:比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗→蒸馏水漂洗2次→待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

52拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。光面毛面若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

53比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。容量的2/3比色皿的光面要与光源在一条线上。光透过窗口中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

54福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

55蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

56蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法，BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

57蛋白质不同方法比较中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

58一、实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

59二、实验仪器1.卵清蛋白片2.7200分光光度计3.试管4.移液管三、实验试剂1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

60四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

61中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

62【注意事项】1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长640nm。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

63【思考题】蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优缺点？中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

64附：标准曲线EXCEL表制作：1、将浓度和所测OD值输入到EXCEL表中。2、将数据区域全部选中。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

653、点击“图表向导”键。4、在图标类型中选择“XY散点图”，然后点击第一个图。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

665.点击“下一步”。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

676、在“图表选项”的“标题”中，于选中的红色区域内可以填入相应的名称。然后点击“完成”。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

687、鼠标点住数值点，右键单击，选择”添加趋势线”中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

698、在“添加趋势线”对话框中选择“线性”分析类型，然后点“确定”。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

709、点住直线右键单击，点“趋势线格式”，对标准曲线进行编辑。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

7110、在“选项”中勾选“显示公式”和“显示R平方值”两项，点“确定”中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

7211、曲线上会显示出此标准曲线的回归方程和R2，将样品测得的OD值（即Y值）代入方程，就得出样品的浓度（即X值）。这里的R2表示标准曲线的线性，即R2越接近于1，你所测的数值越准确，也越具有说服力。一般要求至少R2=0.99以上为好。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

73氨基酸的纸层析中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

74层析技术介绍一、定义层析技术(chromatography）也称色谱技术，是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。具体的说是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配以获得分离的方法。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

75固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

76二、层析技术的原理层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

77三、发展简史层析分离技术在20世纪初就已得到应用：1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

78四、层析技术的种类◆按层析的机理划分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

79◆按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。◆按操作形式划分：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

80一、实验目的1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌握影响分配系数的因素。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

81二、实验原理纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

82分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数α是一个常数。溶质在固定相的浓度(Cs)分配系数α=溶质在流动相的浓度（Cl)中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

83移动速率(比移值)：原点到层析点中心的距离Rf=原点到溶剂前沿的距离中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

84影响Rf值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。（1）物质的结构和分子极性：物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf则较大。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

85溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

86（2）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高。其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85。再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇-甲酸-水系统久放易引起酯化。（3）pH值：溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变；中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

87（4）滤纸：层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）.中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

88（5）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层析必须在恒温条件下进行。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

89（6）展开方式：上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。（7）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

90二、实验仪器1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器三、实验试剂1、 混合氨基酸（甘氨酸，苯丙氨酸,精氨酸,酪氨酸,谷氨酸）2、展层剂：正丁醇：氨水：乙醇：蒸馏水=1３:3：３：１（v:v）3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

91四、试验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2～3cm处用铅笔画一横线，在线上画两个点（原点）。2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液和谷氨酸标准液，在上面两个点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2～3次为佳。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

923、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

93五、实验结果与计算：1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室

941、分析影响分配系数的因素有哪些？2、何谓分配层析法，分配系数？【思考题】

95醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白

96电泳技术：电泳(electrophoresis)：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳动的现象。正极负极带负电粒子带正电粒子电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。

97电泳法：利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的方法和技术。在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。

981809年，俄国物理学家Peиce首次发现电泳现象；1937年，KaurinTiselius发明了Tiselius电泳仪，建立了自由界面电泳，首次证明人血清蛋白的组分；1948年，Wieland和Fischer以滤纸作为支持介质的电泳；1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成凝胶作为介质——聚丙烯酰胺凝胶电泳:生物大分子的“LastCheck”！KaurinTiselius(1902-1971)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖1948诺贝尔生理医学奖。

99（－）（+）----------------------------表面带负电荷++++++++++++++++带正电荷的水层（－）（+）+++++++++++++++++表面带正电荷---------------------------带负电荷的水层++

1001、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象2.影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量质点的大小和形状电泳的影响因素：

101电泳的分类:根据电泳中是否使用支持介质分为：自由界面电泳区带电泳根据电泳系统pH是否连续分为：连续pH电泳不连续pH电泳按支持物的装置形式不同分为：水平板式电泳垂直板式电泳垂直柱式电泳根据电泳物质类别不同分为：细胞电泳，核酸电泳，蛋白质电泳等按其介质的物理性状不同可分为：凝胶电泳粉末电泳线丝电泳纤维膜电泳等

102一、实验目的1.了解醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的操作步骤3.熟悉电泳仪器的使用和操作。

103二、实验原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。

104血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β、γ五条区带。

1053.醋酸纤维素薄膜纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。具有均一的泡沫状结构（厚约120m），渗透性强，对分子移动的阻力很弱。用其作支持物进行电泳，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。

1061、 牛血清2、 醋酸纤维薄膜3、 镊子4、 电泳仪5、 电泳槽6、 盖玻片三、实验仪器

1071、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。2、 染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。3、 漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。三、实验试剂

1081.薄膜准备四、实验步骤将薄膜置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，浸泡30min以上，方可用于点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间吸干多余的缓冲液，然后平铺在桌子上（毛面朝上）注意：整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。注意：不要将薄膜吸的太干，否则电流无法通过；也不要太湿，点样时容易扩散。

109用点样器蘸取少量血清，以印章法点样。2.点样：注意：点样处距离膜边缘约1.5cm处，位置居中点样时，轻压1-2S，使血清渗透到薄膜内点样只可一次，不能重复点样点样要求：细、直、不接触边缘

110根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条制作滤纸桥3.上样：连接电泳仪和电泳槽将薄膜毛面朝下，点样端朝向负极置于滤纸桥上（注：不可让点样处接触滤纸桥）排空膜上的气泡

111平衡：盖上电泳槽盖，平衡5min至膜完全湿润电泳：稳压，110V，约1.5h（至第一条带到达膜条2/3处为止）4.电泳：

112染色：用镊子将膜条夹至氨基黑10B中染色10min.注意：薄膜条要完全浸入染色液且每条要分开，不重叠.(染色液回收)漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，再浸入蒸馏水中。5.染色及漂洗：注意：漂洗薄膜时，请做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，这样既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。

113将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干，浸入透明液完全干燥后，薄膜完全透明，可作扫描描或照相，将该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分可长期保存。（不做）六、透明

114五、记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的几条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在实验报告上，并判断分析其结果。

115清蛋白57.45-71.73%a1-球蛋白1.76-4.48%a2-球蛋白4.04-8.28%β-球蛋白6.79-11.39%γ-球蛋白11.8522.97%A/G1.24-2.36实验结果：正常参考值：

116注意事项：1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。2、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。4、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。

117【思考题】1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？

118其他主要电泳技术介绍：1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于蛋白质分子量的测定，有垂直板、平板、盘状电泳

1192、等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质。3、双向凝胶电泳：蛋白质组学研究的重要技术。4、琼脂糖凝胶电泳：分离DNA或RNA分子

120胰蛋白酶活力测定

121酶的定义是一类生物催化剂。是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。

122酶的化学组成蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)

123辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。

124必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。活性中心：酶分子中必需基团相对集中，构成一定空间结构区域，与催化作用直接相关。酶的活性中心活性中心结合部位（底物）催化部位（底物的键在此处被打断或形成新的键）

125底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心

126酶的活力酶活力（enzymeactivity）：是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位（国际单位）：标准状态下，每分钟使一微克分子作用物发生转变的酶量。人们普遍采用是习惯用法，如a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表示。

127福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。一、实验原理

128试管7200分光光度计恒温水浴锅二、实验仪器

129福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml10%三氯乙酸溶液0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：0.5%酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0.2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。500ug/mL酪氨酸溶液7.胰蛋白酶溶液(冰箱中)三、实验试剂

130四、实验步骤1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15分钟，测OD680。以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。

1312、样品测定：取干燥的试管1支，按下表加入试剂

132五、结果计算酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数

133【思考题】1、酶的实验为何设对照又设空白？2、如何保证本实验测定数据的准确性？3、稀释的酶液是否可以长期保存？为什么？

134酵母RNA的提取与鉴定

135

136RNA提取方法稀碱法(0.2%NaOH)浓盐法(10%NaCl)苯酚法氯仿-异戊醇法去污剂法盐酸胍法RNA提取方法

1371、苯酚法实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。

138是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。3、浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。2、稀碱法

139一、实验目的掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法

140二、实验原理酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。

141RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。RNA在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作催化剂。

142三、实验仪器离心机水浴锅电炉烧杯量筒

143四、实验试剂干酵母粉0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。乙酸95%乙醇无水乙醚10%硫酸氨水5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。

144五、实验步骤1.酵母RNA的提取：称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升,洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醇滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。

1452.鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。1)水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物,有时沉淀出现比较慢,需要静止10几分钟。2)取水解液0.5mL,加苔黑酚-三氯化铁试剂1mL，加热至沸1min,观察颜色变化。

146注意事项：离心的时候，要两两对称放置，且离心管中溶液的量基本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。离心管回收

1471、简述核酸分离纯化的一般原则。2、RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？【思考题】

148DNA的定量测定二苯胺法

149一、实验目的1、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。2、复习和掌握标准曲线的制作方法

150二、实验原理DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。（λmax=595nm）。DNA在20—200微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，可用比色法测定。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

151试管移液管7200分光光度计恒温水浴锅三、实验仪器

152三、实验试剂1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可

1531.标准曲线的绘制取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。五、试验步骤

1542.样品测定吸取DNA样液1ml，加入二苯胺溶液3.0ml,加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。

155注意事项：1.此方法测定DNA含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml,则难以测定。2.样品中少量的RNA并不影响测定,但是蛋白质,多糖及其衍生物,芳香醛,羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。

1561、DNA制品可用哪几种方法测定其含量，试从原理、准确性等方面加以比较。2、实验中加入乙醛的作用是什么，请详细说明？【思考题】

157维生素C的定量测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）

158维生素C的作用1.参与氨基酸代谢2.降低毛细血管通透性3.刺激凝血功能4.增加抵抗感染5.参与解毒6.抗组胺7.阻止致癌物质生成8.补充营养9.治疗坏血病10.治疗牙龈肿胀，牙龈出血11.治疗各种急慢性传染病12.辅助治疗过敏性疾病13.参与神经递质，胶原当白和组织细胞间隙的合成14.病后恢复期，创伤愈合期的辅助治疗

159注意！长期服用维生素，会给人体带来隐患。原因：人体逐渐适应高剂量维生素一停用，就可能出现维生素缺乏症

160维生素C的性质物理性质六碳多羟基酸性化合物；白色针状结晶；味酸,可溶于水化学性质烯醇式己糖酸内酯,有L型和D型的两种异构体；只有L型有生理功效；具有酯键,应具备酯的化学性质；在酸性环境中稳定存在

161维生素C的测定方法维生素C的测定方法有很多，主要分为：光度法、电化法和色谱法三大类。主要方法包括：荧光法2，6-二氯靛酚滴定法（还原型VC）2，4-二硝基苯肼法碘量法电位滴定法等

162维生素c又称为抗坏血酸，其还原型能还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6-二氯酚靛酚成红色，被还原后变为无色。因此可用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中含有的维生素C，当样品中的维生素C被完全氧化后，在滴加过量的2，6-二氯酚靛酚，溶液变为淡红色，即为终点。如无其他杂质干扰，则样品液所还原的2，6-二氯酚靛酚的量与样品中所含有维生素C的量成正比。一、实验原理

163维生素C2,6-二氯酚靛酚维生素C2,6-二氯酚靛酚（还原型）（氧化型，粉红色）（氧化型）（还原型）++====2,6-二氯酚靛酚染料的钠盐在水溶液中显蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后红色消失。

164新鲜水果（橙子或猕猴桃）5ml和10ml吸管100ml或50ml容量瓶微量滴定装置250ml锥形瓶研钵漏斗二、实验材料和仪器

1651、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。2、标准维生素C液：准确称取10.0mg维生素C，溶于1%草酸溶液，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配制。此溶液浓度0.1mg/ml.3、0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：称取500mg2，6-二氯酚靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氢钠的热水中，冷却，加蒸馏水并稀释至500ml，滤去不溶物，贮于棕色瓶中，冷藏。三、实验试剂

166四、实验步骤1.样品中抗坏血酸的提取：将水果用水洗干净，用滤纸吸取表面水分。称取3.0g，加2%草酸试剂5ml置研钵中研成浆状(研的越细越好)。将上述浆状物倒入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液稀释并定容，混匀，静止10分钟，过滤（最初数毫升滤液弃去），滤液备用。

1672.样品滴定样品液的滴定：准确吸取滤液两份，每份10ml，分别放入两个100ml锥形瓶中，用2，6-二氯酚靛酚滴定至淡红色。滴定终点要保持15秒钟。注：1ml2，6-二氯酚靛酚染料相当于1毫克抗坏血酸。

168按下式计算100mg样品中含抗坏血酸的毫克数：m=V×T/W×100V=滴定时所用染料ml数T=每毫升染料氧化抗坏血酸质量W=10ml样液相当于含样品的质量数五、结果计算

169注意事项1、2，6-二氯酚靛酚钠盐溶液要节约使用。多余的，洁净的要回收。2、此滴定管为微量滴定管，最大刻度为2ml。3、滴定过程宜迅速，最好不要超过2min

1701.2,6-二氯酚靛酚滴定法测定Vc含量的优缺点?2.此实验测定误差的可能来源?3.维c定量各种测定方法的比较？【思考题】

171聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白

172一、实验目的1、掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。2、熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本过程。

173二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。

174由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。Bis：交联剂过硫酸铵(AP)：引发剂，提供自由基，引发聚合反应四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂,加快引发释放自由基的速度聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）的聚合反应：

175三大效应：1、浓缩效应：缓冲液离子成分、PH的不连续性电极缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶（浓缩胶）中缓冲液为pH6.7Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。

176不连续系统有效迁移率=迁移率解离度氯离子>蛋白质阴离子>甘氨酸阴离子

1772、分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。3.电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷越多迁移越快

178三、实验仪器电泳仪电泳槽注射器长针头吸管培养皿

179四、实验试剂三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4℃条件下，以防变质。染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。脱色液：30ml乙醇，10ml乙酸，加水至100ml。电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸2.88g，Tris0.6g加水定容至1000ml.示踪剂：0.05%溴酚蓝溶液。

180

181五、实验步骤1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）：将试剂按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中25~35℃下聚合，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。

1822）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7，浓缩胶）：将试剂按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。然后胶管于烘箱中25℃~35℃下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。

1832.安装胶管把玻璃管下端的橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。

1843.加样0.5ml新鲜血清，用5ml20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释（有老师配制）。用微量注射器或移液枪向胶管内加10ul样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。4.电泳上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约1小时。电泳完,上层缓冲液倒入大烧杯,下层缓冲液不动

1855.剥胶取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。6.染色及洗脱用考马斯亮蓝R250染色，将染色试管倒入R250染色液染色30分钟。放入漂洗液,过夜,明天过来换一次液。注:染液回收7.观察绘图将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。

186结果示意图：γβα2α1

187注意事项：所有玻璃管和绿套头，在剥胶完毕后回收回讲台盒子中。所有乳胶帽，在胶凝固后都回收回讲台的盒子中所有针管和针头剥胶完成后回收回讲台请本组为下组实验做胶

1881、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应？2、上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？3、为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？【思考题】